一种新型冠状病毒多表位重组抗原及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种新型冠状病毒多表位重组抗原及其制备方法。本发明专利技术涉及一种重组抗原，该重组抗原包含新型冠状病毒多个优势抗原表位，并采用CHO细胞偏爱密码子将该重组抗原氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体，从而提高该重组抗原在CHO细胞中的表达量。另外，经验证该重组抗原可与新型冠状病毒不同抗原免疫得到的鼠血清产生免疫学反应。

A novel coronavirus multi epitope recombinant antigen and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒多表位重组抗原及其制备方法
本专利技术属于生物
，公开了一种新型冠状病毒多表位重组抗原及其制备方法。本专利技术涉及一种重组抗原，该重组抗原包含新型冠状病毒多个优势抗原表位，并采用CHO细胞偏爱密码子将该重组抗原氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体，从而提高该重组抗原在CHO细胞中的表达量。另外，经验证该重组抗原可与新型冠状病毒不同抗原免疫得到的鼠血清产生免疫学反应。
技术介绍
2019新型冠状病毒，即“2019-nCoV”，是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。冠状病毒是一个大型病毒家族，在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，只感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。冠状病毒粒子呈不规则形状，病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(S，SpikeProtein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点)；小包膜糖蛋白(E，EnvelopeProtein，较小，与包膜结合的蛋白)；膜糖蛋白(M，MembraneProtein)，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)。其中刺突蛋白(spikeprotein)是冠状病毒最重要的表面蛋白，与病毒的传染能力相关。刺突蛋白含有两个亚基：S1和S2，其中S1主要包含受体结合区域(RBD)，负责识别细胞受体，S2含有膜融合过程所需的基本元件。目前，新型冠状病毒检测以核酸分子检测为主，需要从痰液、咽拭子、肺泡灌洗液等样本中提取核酸分子，然后再采用荧光PCR方法进行检测，总共需要3个小时左右。该方法虽然准确度高，但是需要专门的操作场地、专业的操作人员，专业的设备，检测时间太长，要求较为苛刻，无法在基层医疗机构大面积使用。而新型冠状病毒疫情爆发后，疑似患者大量增加，急需一种检测产品能在短时间内快速鉴别筛查，而不仅仅是确诊。
技术实现思路
设计目的：避免
技术介绍
中的不足之处，设计一种新型冠状病毒多表位重组抗原及其制备方法，使得重组抗原能够识别新型冠状病毒特异性抗体，从而实现新型冠状病毒诊断，通过新型冠状病毒多表位重组抗原进行检测不仅能够增强检测灵敏度，而且不会导致检测结果失真。设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以新型冠状病毒S、E、M为靶抗原，分析并选择三个特异性优势抗原表位，序列比较结果显示所选择的三个抗原表位与冠状病毒抗原之外的其它抗原序列无明显同源性。(2)将所选择的三个优势抗原表位序列通过柔性片段连接，并在序列碳端加His标签，得到重组抗原氨基酸序列。(3)采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)偏爱密码子，将重组抗原氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体pTT5,构建重组抗原表达载体。(5)重组抗原表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选鉴定得到重组表达质粒。(6)重组表达质粒瞬转CHO细胞，7天后收集细胞上清。(7)上清通过镍琼脂糖亲和层析纯化得到重组抗原。(8)将重组抗原应用于胶体金快速检测试剂及ELISA平台，可识别新型冠状病毒不同抗原免疫得到的鼠血清。技术方案1：一种新型冠状病毒多表位重组抗原，该重组抗原具有如序列表SEQIDNo:1所示的氨基酸序列。技术方案2：一种新型冠状病毒多表位重组抗原，该重组抗原包含如序列表SEQIDNo:2、SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的氨基酸序列。技术方案3：一种核苷酸序列，该核苷酸序列如序列表SEQIDNo:5所示，可编码权利要求1-2所述的新型冠状病毒多表位重组抗原。技术方案4：一种质粒载体，该质粒载体含有权利要求3所述的核苷酸序列。技术方案5：一种菌株，该菌株包含采用权利要求4所述的质粒载体。技术方案6：一种新型冠状病毒多表位重组抗原的制备，包括：(a)人工设计并辅以计算机模拟新型冠状病毒S、E、M抗原的优势表位，化学合成包含BamHI和EcoRI酶切位点的核苷酸序列；(b)将化学合成产物BamHI和EcoRI双酶切后连接至同样BamHI和EcoRI双酶切的pTT5载体中，得重组质粒载体；(c)重组质粒转染CHO-K1细胞表达，细胞上清纯化透析即得SEQIDNo:1所示氨基酸序列的新型冠状病毒重组抗原。本专利技术与
技术介绍
相比，一是通过分子生物学技术，实现了新型冠状病毒不同抗原多个优势表位的串联表达，增强了抗原对冠状病毒抗体的识别能力，提高了灵敏度，同时排除了无关序列可能带来的假阳性风险，提高了特异性；二是采用CHO细胞作为表达宿主，并以CHO细胞偏爱密码子优化重组抗原对应的核苷酸序列，不仅使所表达抗原具有糖基化特点，并且提高了表达量；三是将重组抗原应用于胶体金快速检测试剂及ELISA平台，可识别新型冠状病毒不同抗原免疫得到的鼠血清。附图说明图1是S抗原鼠血清的检测对照示意图。图2是E抗原鼠血清的检测对照示意图。图3是M抗原鼠血清的检测对照示意图。具体实施方式以下实施例虽然对本专利技术的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本专利技术设计思路的简单文字描述，而不是对本专利技术设计思路的限制，任何不超出本专利技术设计思路的组合、增加或修改，均落入到本专利技术的保护范围内。实施例1：新型冠状病毒优势抗原表位选择利用生物软件DNAstar分析新型冠状病毒S、E、M抗原表位序列的亲水性、疏水性及抗原性，分别选择S抗原优势表位(SEQIDNo:2)、E抗原优势表位(SEQIDNo:3)和M抗原优势表位(SEQIDNo:4)。同时，序列比较结果表明所选择优势抗原表位序列特异性高，与冠状病毒抗原之外的其它抗原序列无明显同源性。实施例2：S、E、M抗原优势表位串联为增强重组抗原对新型冠状病毒抗体的识别能力，将S、E、M抗原优势表位通过柔性片段(GlyGlyGlyGlySer)连接,并在序列碳端加His标签，得到重组抗原氨基酸序列，其具体序列如序列表SEQIDNo:1所示。实施例3：优化编码重组抗原的核苷酸序列为了提高重组抗原表达量，在重组抗原氨基酸序列不变的前提下,根据CHO细胞偏爱密码子将编码重组抗原氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，具体序列如序列表SEQIDNo:5所示，并在其上下游分别添加酶切位点EcoRI和BamHI对应的核苷酸序列后，由杭州贤至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因克隆于pMD19-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。实施例4：构建重组抗原表达载体用限制性内切酶EcoRI和BamHI(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pTT5载体12小时，酶切产物分别行1％琼本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒多表位重组抗原，其特征在于该重组抗原具有如序列表SEQ IDNo:1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒多表位重组抗原，其特征在于该重组抗原具有如序列表SEQIDNo:1所示的氨基酸序列。


2.一种新型冠状病毒多表位重组抗原，其特征在于该重组抗原包含如序列表SEQIDNo:2、SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的氨基酸序列。


3.一种核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列如序列表SEQIDNo:5所示，可编码权利要求1-2所述的新型冠状病毒多表位重组抗原。


4.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求3所述的核苷酸序列。


5.一种菌株，其特征在于该菌株包含采用权利要求4所述的质粒载体。
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【专利技术属性】
技术研发人员：项美华，王小娟，曹丹琴，武戌青，冯俊涛，余铭恩，
申请(专利权)人：杭州贤至生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33