一种猫杯状病毒（FCV）重组蛋白单克隆抗体及制备方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域。本发明专利技术涉及一种重组蛋白，该重组蛋白包含猫杯状病毒(FCV)(Feline calicivirus,FCV)蛋白的两个优势抗原表位，为提高该重组蛋白在原核表达系统中的产量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体。本发明专利技术还涉及用该重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，经淘选筛选得到对应猫杯状病毒(FCV)蛋白单链抗体scfv序列，将得到的scfv序列构建成完整鼠IgG1抗体序列表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达单克隆抗体，纯化单克隆抗体并分别标记铕离子(Eu

【技术实现步骤摘要】
一种猫杯状病毒(FCV)重组蛋白单克隆抗体及制备方法


[0001]本专利技术属于生物工程
具体来说，本专利技术涉及一种新的重组蛋白，涉及使用上述重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，筛选得到特异性单链抗体scfv序列，还涉及将得到的scfv序列构建成真核表达载体表达猫杯状病毒(FCV)蛋白单克隆抗体，并应用于猫的上呼吸道感染的早期诊断。

技术介绍

[0002]猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)属于杯状病毒科的成员之一，是猫的一种重要病原。近年来，有高致病性的FCV毒株(VSD
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FCV)在一些国家相继爆发，该毒株可引起感染猫全身性多系统病变，死亡率较高。猫杯状病毒(FCV)感染的主要症状是发热(40℃左右)、口腔溃疡(舌或者上下颚)、鼻腔炎症、结膜炎、间质性肺炎、多发性关节炎等。病猫精神欠佳、打喷嚏，口腔及鼻腔分泌物增多，流涎，眼鼻分泌物开始为浆液性、4～5天后为脓性，角膜发炎、可导致失明。口腔溃疡是为最显著的特征，以舌和硬腭、腭中裂周围明显，出现大面积的溃疡和肉芽增生，病猫进食困难，容易造成营养不良、脱水甚至死亡。猫杯状病毒(FCV)的潜伏期一般在二至三日，病毒毒力较强时，可发生肺炎，呼吸困难，肺部有干性或湿性啰音，三个月以下幼猫可因肺炎致死。杯状病毒感染如不继发其他病毒(传染性鼻气管炎病毒)、细菌性感染，7～10天后可自行恢复，但往往成为带毒猫。
[0003]疫苗接种是防治本病最有效方法，但现有疫苗的保护效果并不理想，临床上主要有对症治疗和支持治疗相结合的方法。在猫感染病毒初期，对于呼吸道感染情况，除使用抗病毒药物、干扰素和抗生素，防止继发感染以外，还需要进行吸氧、雾化治疗，帮助猫咪化痰止咳；当出现呼吸困难，可通过吸氧进行缓解，建议选用速诺和强力霉素这两种混合联合用药。因此，控制本病的根本措施，在于免疫预防和检疫。
[0004]目前获得猫杯状病毒(FCV)单克隆抗体主要是通过杂交瘤技术。但杂交瘤技术获得单抗具有一定的局限性：(1)针对动物毒性抗原、自身抗原、免疫耐受原和弱免疫原性抗原，由于无法产生有效免疫，故而不适合采用杂交瘤技术来制备抗体。(2)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。(3)作为异源杂合二倍体细胞，候选杂交瘤克隆需要亚克隆后才能稳定。不及时亚克隆的候选杂交瘤细胞不稳定，容易丢失阳性克隆。而挑选阳性克隆，尤其是复杂的功能筛选，需要一定的时间窗口，窗口越长，功能筛选越成熟和可信。微量冻存候选克隆可以延长功能筛选时间窗口，但功能检测需要足够量的抗体蛋白，因此批量亚克隆仍然需要大的工作量。杂交瘤筛选失败后的应对方案是重新免疫或者重新融合(也受限于免疫后小鼠的饲养周期)，必然产生时间成本。
[0005]因此制备猫杯状病毒(FCV)蛋白单克隆抗体用于猫杯状病毒(FCV)特异性识别检测成为早期诊断的主要方式。常规猫杯状病毒(FCV)蛋白单克隆抗体制备是将猫杯状病毒(FCV)蛋白单克隆细胞株制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体。但由于单只小鼠腹水产量不确定性且个体差异大，得到的抗猫杯状病毒(FCV)蛋白单克
隆抗体批间差异大，使得检测准确性较差。

技术实现思路

[0006]为解决
技术介绍
中制备单克隆抗体的不足之处，通过设计、合成猫杯状病毒(FCV)蛋白并通过建立噬菌体库和真核细胞表达来制备其单克隆抗体，以达到节省时间，而且能降低批间差异，提高检测准确性的目的。
[0007]为了实现上述目的。本申请提供了：
[0008]一种抗猫杯状病毒(FCV)特异性单链抗体scfv
‑
3C5，包括轻链和重链，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]一种抗猫杯状病毒(FCV)特异性单链抗体scfv
‑
5E2，包括轻链和重链，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]一种编码权利要求1所述的猫杯状病毒(FCV)特异性单链抗体scfv
‑
3C5的基因，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0011]一种编码权利要求2所述的猫杯状病毒(FCV)特异性单链抗体scfv
‑
5E2的基因，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0012]一种质粒载体，该质粒载体含有编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
[0013]一种质粒载体，该质粒载体含有编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
[0014]一种质粒载体，该质粒载体含有编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
[0015]一种质粒载体，该质粒载体含有编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
[0016]上述质粒载体在真核表达猫杯状病毒(FCV)单克隆抗体的应用，包括：
[0017](a)通过PCR将上述轻链和重链核苷酸序列分别与鼠IgG1轻链恒定区和重链恒定区核苷酸序列桥接后酶切，并分别连接质粒载体，构建真核细胞表达载体；
[0018](b)将步骤(a)中真核表达载体转染至HEK293F细胞表达得到猫杯状病毒(FCV)单克隆抗体；
[0019](c)纯化单克隆抗体通过免疫荧光正交实验确定为最佳单抗配对组合。
[0020]有益效果：采用免疫抗体库筛选猫杯状病毒(FCV)蛋白单克隆抗体，同等免疫条件下，候选克隆越多，越容易筛选出高活性抗体，并且抗体库一旦建成，就可以无限期保存。原始噬菌体库就足以反复筛选，无需重新建库，筛选单抗时仅需取少量噬菌体颗粒。此外，亲和淘选的方式既可以特异性富集结合抗原的抗体，还可以尽量扣除与对照蛋白结合的抗体，有效提高筛选效率。(1)以猫杯状病毒(FCV)蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原的两个特异性优势抗原表位，序列比对结果显示所选择的两个抗原表位与其他蛋白序列无明显同源性。(2)为了促进所选择优势抗原表位对Balb/c小鼠免疫系统的刺激，增强免疫效果，将所选择的两个优势抗原表位序列通过柔性片段串联形成重组蛋白氨基酸序列。(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入原核表达载体PET
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32a，构建重组蛋白表达载体。(5)重组蛋白表达
载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，加氨苄青霉素抗性筛选培养基筛选得到重组蛋白表达菌株。(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.猫杯状病毒(FCV)蛋白特异性单链抗体scfv
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3C5，包括轻链和重链，其特征在于：所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.猫杯状病毒(FCV)蛋白特异性单链抗体scfv
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5E2，包括轻链和重链，其特征在于：所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种编码权利要求1所述的猫杯状病毒(FCV)蛋白特异性单链抗体scfv
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3C5的基因，其特征在于：编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。4.一种编码权利要求2所述的抗猫杯状病毒(FCV)蛋白特异性单链抗体scFv
‑
5E2的基因，其特征在于：编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7...

【专利技术属性】
技术研发人员：余昌静，洪淑凡，武妮妮，楼莹，余铭恩，敖翔，
申请(专利权)人：杭州贤至生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：