本发明专利技术属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种重组蛋白，该重组蛋白氨基酸序列由肌钙蛋白I(Cardiac Troponin I，cTnI)两个优势表位重复串联组成，并采用大肠杆菌偏爱密码子将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成核苷酸序列并构建重组表达载体，从而提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量。本发明专利技术还涉及用该重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，经淘选筛选得到对应肌钙蛋白I单链抗体scfv序列，将得到的scfv序列构建成完整鼠IgG1抗体序列表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达单克隆抗体，纯化单克隆抗体，通过免疫荧光正交实验确定最佳单抗配对组合。单抗配对组合。
【技术实现步骤摘要】
肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体及制备方法
[0001]本专利技术属于生物
具体地说，本专利技术表达了一种新的重组蛋白，涉及使用上述重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，筛选得到特异性单链抗体scfv序列，还涉及将得到的scfv序列构建成真核表达载体表达肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体，并应用于急性心肌梗死的早期诊断。
技术介绍
[0002]急性心肌梗死是严重危害人类健康的常见疾病之一。肌钙蛋白是心肌损伤坏死的标志物，对急性心肌梗死的诊断和危险分层有重要的临床意义(诊断敏感性100％，特异性91％，且持续时间长)。肌钙蛋白值升高提示心肌损伤，可见于急性心肌梗死、不稳定性心绞痛、肺梗死、心力衰竭休克及其他导致心肌损伤的疾病如胰腺炎、严重糖尿病酮症酸中毒、结缔组织疾病等，数值越高，损伤范围越广，在急性心肌梗死患者，3～6小时开始释放，10～24小时达到高峰，恢复正常时间cTnT和cTnI分别为10～15天和5～7天；部分肾功能不全患者亦可出现升高。
[0003]目前诊断心肌梗死主要依赖于心电图、磁共振、冠状造影等，需要特殊设备与仪器、需要专业人员操作而且不能进行现场检测。制备肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体可以用于心肌梗死的早期诊断。常规肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体制备是将肌钙蛋白I(cTnI)单克隆细胞株制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体。但由于单只小鼠腹水产量不确定性且个体差异大，得到的抗肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体批间差异大，使得检测准确性较差。
[0004]目前主要通过杂交瘤技术获得肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体。杂交瘤技术获得单抗的劣势体现在：(1)针对动物毒性抗原、自身抗原、免疫耐受原和弱免疫原性抗原，由于无法产生有效免疫，故而不适合采用杂交瘤技术来制备抗体。(2)细胞融合后，产生的候选克隆数量少。即使采用电融合技术，候选克隆一般最多达到104个，而抗体库的容量可以达到10
10
以上。(3)作为异源杂合二倍体细胞，候选杂交瘤克隆需要亚克隆后才能稳定。不及时亚克隆的候选杂交瘤细胞不稳定，容易丢失阳性克隆。而挑选阳性克隆，尤其是复杂的功能筛选，需要一定的时间窗口，窗口越长，功能筛选越成熟和可信。微量冻存候选克隆可以延长功能筛选时间窗口，但功能检测需要足够量的抗体蛋白，因此批量亚克隆仍然需要大的工作量。杂交瘤筛选失败后的应对方案是重新免疫或者重新融合(也受限于免疫后小鼠的饲养周期)，必然产生时间成本。(4)出于伦理考虑，限制了人杂交瘤技术的发展和应用。通常杂交瘤单克隆抗体是动物抗体，用于开发药物必须将抗体进行人源化改造。
技术实现思路
[0005]为解决
技术介绍
中单克隆抗体的不足之处，通过设计、合成重组肌钙蛋白I(cTnI)蛋白并通过建立噬菌体库和真核细胞表达来制备其单克隆抗体，以达到比传统单克隆抗体制备大大缩短了时间，并且得到的单克隆抗体稳定性高，均一性好，大大减小了批间差异的
目的。
[0006]为了实现上述目的。本申请提供了：
[0007]一种抗肌钙蛋白I(cTnI)特异性单链抗体scfv
‑
2B6，包括轻链和重链，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]一种抗肌钙蛋白I(cTnI)特异性单链抗体scfv
‑
5E3，包括轻链和重链，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]一种编码权利要求1所述的肌钙蛋白I(cTnI)特异性单链抗体scfv
‑
2B6的基因，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0010]一种编码权利要求2所述的肌钙蛋白I(cTnI)特异性单链抗体scfv
‑
5E3的基因，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0011]一种质粒载体，该质粒载体含有编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0012]一种质粒载体，该质粒载体含有编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0013]一种质粒载体，该质粒载体含有编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0014]一种质粒载体，该质粒载体含有编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0015]上述质粒载体在真核表达肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体的应用，包括：
[0016](a)通过PCR将上述轻链和重链核苷酸序列分别与鼠IgG1轻链恒定区和重链恒定区核苷酸序列桥接后酶切，并分别连接质粒载体，构建真核细胞表达载体；
[0017](b)将步骤(a)中真核表达载体转染至HEK293F细胞表达得到肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体；
[0018](c)纯化单克隆抗体通过免疫荧光正交实验确定为最佳单抗配对组合。
[0019]有益效果：采用免疫抗体库筛选肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体，同等免疫条件下，候选克隆越多，越容易筛选出高活性抗体，并且抗体库一旦建成，就可以无限期保存。原始噬菌体库就足以反复筛选，无需重新建库，筛选单抗时仅需取少量噬菌体颗粒。此外，亲和淘选的方式既可以特异性富集结合抗原的抗体，还可以尽量扣除与对照蛋白结合的抗体，有效提高筛选效率。通过此方法生产的肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体批次间差异小，使得检测准确性提高。
[0020](1)以肌钙蛋白I(cTnI)为靶抗原，分析并选择该抗原两个优势抗原表位，序列比较结果显示所选择的两个抗原表位是所有肌钙蛋白I(cTnI)共有表位并与其他蛋白序列无明显同源性。
[0021](2)为增强免疫效果并缩短单克隆抗体制备时间，将所选择的两个优势抗原表位串联，用其免疫小鼠。
[0022](3)为提高该重组蛋白表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列
转换为对应的核苷酸序列。
[0023](4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET
‑
32a(+)，构建重组肌钙蛋白I(cTnI)表达载体。
[0024](5)重组肌钙蛋白I(cTnI)表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，筛选得到重组蛋白表达菌株。
[0025](6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，经超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化重组肌钙蛋白I(cTnI)。
[0026](7)重组肌钙蛋白I(cTnI)蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏分离淋巴细胞用来建立单链抗体scfv噬菌体展示库，使用重组肌钙蛋白I(cTnI)蛋白进行多轮淘选筛选最终得到本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.抗肌钙蛋白I(cTnI)特异性单链抗体scfv
‑
2B6，包括轻链和重链，其特征在于：所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.抗肌钙蛋白I(cTnI)特异性单链抗体scfv
‑
5E3，包括轻链和重链，其特征在于：所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种编码权利要求1所述的肌钙蛋白I(cTnI)特异性单链抗体scfv
‑
2B6的基因，其特征在于：编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。4.一种编码权利要求2所述的肌钙蛋白I(cTnI)特异性单链抗体scfv
‑
5E3的基因，其特征在于：编码轻链可变区的核苷酸序列如SE...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋静，王建玲，项美华，徐琴，余卫，余铭恩，
申请(专利权)人：杭州贤至生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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