轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法技术

本发明专利技术提供了一种重组蛋白，该重组蛋白氨基酸序列由轮状病毒VP6的两个优势抗原表位串联组成，本发明专利技术还涉及用该重组蛋白免疫小鼠，通过流式细胞仪分选出与重组蛋白特异性结合的B淋巴细胞，利用单细胞PCR技术将这些淋巴细胞中的抗体重链及轻链可变区序列扩增出来，并将其构建成完整鼠IgG抗体表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达并纯化单克隆抗体。利用胶体金免疫层析技术及正交实验确定最佳单抗配对组合，对轮状病毒肠胃炎的早期诊断和防治具有重要意义。重要意义。

【技术实现步骤摘要】
轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法


[0001]本专利技术属于生物工程
本专利技术涉及一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法。

技术介绍

[0002]轮状病毒(Rotavirus，简称RV)感染是波及全球人和动物急性肠胃炎的一种常见疾病，根据VP6的抗原性分为A～G 7个组，其中A、B、C三组分别感染流行于婴幼儿、青壮年、青少年三个年龄阶段。在发展中国家，5岁以下住院的腹泻患儿中有20％—50％是轮状病毒肠炎患者，每年约44万儿童死于轮状病毒肠炎，而且自然感染后的免疫性不完整，可能导致终生反复感染。虽然儿童是轮状病毒的易感人群，成人也有野生型轮状病毒感染的风险，研究发现成年人粪便中轮状病毒与沙门氏菌、志门氏菌等细菌病原体一样常见。因此轮状病毒的预防和检测对人类尤其是儿童的健康有重要的指示作用，对全球卫生医疗发展也具有重大意义。
[0003]国内外对轮状病毒感染的病原学检查方法主要有包括电镜技术、病毒分离培养的经典检测技术，由于病毒颗粒易于降解并且电镜设备昂贵，故电镜技术的应用大大受到限制；包括琼脂糖电泳、PCR技术、分子探针技术等基因检测技术，除了可以定性检测轮状病毒还能对样本中病毒进行定量分析，但是RNA提取较难成功且操作繁琐耗时，需要专门培训的技术人员和特殊的仪器设备；以ELISA双抗体夹心法、单克隆抗体技术、固相免疫分析技术等方法为代表的免疫检测技术在快速诊断轮状病毒方面表现得尤为突出，不仅简化了检测步骤，而且提高了检测轮状病毒的特异性和灵敏度。其中轮状病毒单克隆抗体技术不仅克服了体外培养病毒的限制，减少了对高价免疫血清的需求，还可进行血清分型、毒株鉴别，适用于大规模临床检测和流行病学调查。
[0004]因此制备轮状病毒单克隆抗体成为轮状病毒特异性检测诊断的主要方式。

技术实现思路

[0005]为了实现上述设计目的。
[0006]本专利技术的第一方面，提供了一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体，包括轻链和重链，所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]进一步的，编码如SEQ ID NO.1所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码如SEQ ID NO.2所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0008]本专利技术的第二方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.5所示的轻链可变区核苷酸序列。
[0009]本专利技术的第三方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.6所示的重链可变区核苷酸序列。
[0010]本专利技术的第四方面，提供了一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体，包括轻链和重链，所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]进一步的，编码如SEQ ID NO.3所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码如SEQ ID NO.4所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0012]本专利技术的第五方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.7所示的轻链可变区核苷酸序列。
[0013]本专利技术的第六方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.8所示的重链可变区核苷酸序列。
[0014]本专利技术的第七方面，提供了一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体真核表达质粒载体的方法，包括以下步骤:
[0015]a)通过PCR将轻链可变区核苷酸序列和重链可变区核苷酸序列分别与鼠IgG轻链恒定区核苷酸序列和重链恒定区核苷酸序列桥接后酶切，并分别连接质粒载体，构建真核细胞表达载体；
[0016]b)将步骤a)中真核表达载体转染至HEK293F细胞表达得到轮状病毒重组蛋白单克隆抗体；
[0017]c)纯化单克隆抗体并分别标记胶体金颗粒，通过正交实验确定最佳单抗配对组合；
[0018]所述轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示或如SEQ ID NO.7所示；
[0019]所述重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示或如SEQ ID NO.8所示。
[0020]本申请的有益之处在于：提供了一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法。
[0021]具体实施方案：以下实施例虽然对本专利技术的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本专利技术设计思路的简单文字描述，而不是对本专利技术设计思路的限制，任何不超出本专利技术设计思路的组合、增加或修改，均落入到本专利技术的保护范围内。
[0022]轮状病毒VP6蛋白优势抗原表位选择
[0023]以VP6蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择A优势抗原表位和B优势抗原表位。同时，序列比较结果表明所选择的A、B两个优势抗原表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同源性。
[0024]VP6蛋白优势抗原表位串联
[0025]为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的刺激以利于后续实验的进行，将VP6蛋白的A、B两个优势抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后再重复四次，并在序列碳端加His标签得到重组蛋白氨基酸序列。
[0026]优化编码重组蛋白的核苷酸序列
[0027]为提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列，合成后的目的基因克隆于pMD19
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T载体(宝生物工程大连有限公司)中。
[0028]构建重组蛋白表达载体
[0029]用限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19
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T载体和pET
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28a(+)载体(德国Novagen公司)12小时，酶切产物分别于1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pET
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28a(+)载体。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和pET
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28a(+)载体按一定比例于4℃连接12小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃恒温培养12小时后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(爱思进生物技术杭州有限公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。
[0030]构建重组VP6抗原表达菌株
[0031]将构建好的重组表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体，包括轻链和重链，其特征在于：所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的轮状病毒重组蛋白特异性抗体，其特征在于：编码如SEQ ID NO.1所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码如SEQ ID NO.2所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。3.一种质粒载体，其特征在于：该质粒载体含有如SEQ ID NO.5所示的轻链可变区核苷酸序列。4.一种质粒载体，其特征在于：该质粒载体含有如SEQ ID NO.6所示的重链可变区核苷酸序列。5.一种轮状病毒重组蛋白特异性抗体，包括轻链和重链，其特征在于：所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。6.根据权利要求5所述的轮状病毒重组蛋白特异性抗体，其特征在于：编码如SEQ ID NO.3所示的所述轻链的可变区氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，武戌青，洪淑凡，陈安琪，吴琼杉，余铭恩，
申请(专利权)人：杭州贤至生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：