抗HER2/PD1双特异性抗体制造技术

本发明专利技术属于肿瘤治疗领域，公开了一种抗HER2/PD1双特异性抗体、制备方法和在抗肿瘤中的应用。具体地，单链可变片段scFv和免疫球蛋白抗体IgG通过肽接头连接获得双特异性抗体，该双特异性抗体能靶向肿瘤细胞表面分子HER2和T淋巴细胞表面分子PD1。实验结果显示，本发明专利技术提供的双特异性抗体都能抑制肿瘤细胞生长，并激活T淋巴细胞，促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤。

Anti HER2 / PD1 bispecific antibody

【技术实现步骤摘要】
抗HER2/PD1双特异性抗体
本专利技术属于肿瘤治疗和生物
，涉及一种抗HER2和PD1的双特异性抗体分子制备方法和用途。
技术介绍
HER2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2)，具有受体酪氨酸蛋白激酶活性，是人表皮生长因子受体家族成员之一，只在成年人的少数正常组织中呈低水平表达。但研究表明，HER2在多种肿瘤中过表达，如在约30％的乳腺癌患者和16％的胃癌患者中均存在过度表达情况，HER2在肿瘤中的过表达可以显著促进肿瘤血管的新生、肿瘤的生长，并增强肿瘤的侵袭和转移能力，是这类患者预后较差的重要指征。因此，早在1998年，第一个靶向于HER2的单克隆抗体药物Herceptin(Genentech/Roche)被FDA批准上市，并用于HER2过表达的乳腺癌和胃癌的治疗。人程序性细胞死亡受体-1(PD1)是由288个氨基酸组成的I型膜蛋白，胞外段为负责结合配体的Ig可变型(V-型)结构域，胞内段为负责结合信号转导分子的胞质尾区。PD1胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体，分别为ITIM(免疫受体酪氨酸抑制作用模体)和ITSM(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。PD1表达在已经激活的T淋巴细胞表面，它与配体PD-L1(程序性死亡受体-配体1，programmedcelldeath-Ligand1)和PD-L2(程序性死亡受体-配体2，programmedcelldeath-Ligand2)结合可以抑制T淋巴细胞的活性及相关的体内细胞免疫反应。大量研究表明，PD1和PD-L1的相互作用不仅维持了体内免疫系统的平衡，也是导致PD-L1表达阳性的肿瘤细胞规避免疫监视的主要机制。通过阻断PD1/PD-L1信号通路，能够激活免疫系统，恢复T细胞的免疫杀伤功能。(pembrolizumab)是第一个上市的针对PD1的人源化单克隆抗体，于2014年9月被FDA批准用于治疗黑色素瘤，至2018年获批的适应证包括：黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞癌、膀胱癌、胃癌和带有MSI-H或dMMR的实体肿瘤。(nivolumab)是百时美施贵宝公司的一款PD1单克隆抗体，于2014年12月获FDA批准上市，适应证包括：黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞癌、膀胱癌、结直肠癌和肝细胞癌。由三生国健自主研发的抗PD1单克隆抗体是一种全新的抗PD1人源化单克隆抗体。体内外生物学活性以及抗肿瘤活性研究显示，抗PD1的生物学活性介于阳性对照药Opdivo和Keytruda之间，在某些方面略优于阳性对照药Opdivo。双特异性抗体(bispecificantibody，BsAb)是指能同时结合两个(或多个)不同抗原表位的抗体分子。与传统的单克隆抗体相比，双特异性抗体具有独特的作用机制：1)双特异性抗体可以同时结合2个或多个不同的抗原分子或相同分子的不同表位，而联合用药往往不具备这种效应。2)介导细胞间的相互作用，双特异性抗体可分别结合效应细胞和靶细胞上的两种抗原上，在效应细胞和靶细胞之间架起桥梁，促进细胞间的相互作用，例如介导免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此双特异性抗体具有传统单克隆抗体不具备的独特优势。本专利介绍了一种能靶向肿瘤细胞表面分子HER2和T淋巴细胞表面分子PD1的双特异性抗体。我们的研究表明，本专利技术提供的双特异性抗体能同时结合HER2和PD1抗原；细胞水平和动物水平的实验结果显示，该双特异性抗体能抑制人乳腺癌细胞系BT474，并激活T淋巴细胞，促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤。
技术实现思路
本提供了一种新的能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体，还提供了该双特异性抗体的制备方法和应用。因此，本专利技术的目的在于提供一种能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体；提供编码所述双特异性抗体的核苷酸分子；提供包含所述核苷酸分子的表达载体；提供所述表达载体的宿主细胞；提供所述双特异性抗体的制备方法；提供包含所述双特异性抗体的药物组合物；提供所述双特异性抗体在制备药物中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术一方面提供了一种能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体，其包含免疫球蛋白抗体IgG和两个相同的单链可变区片段scFv，其中每个scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过肽接头L1连接，每个scFv通过接头肽L2与IgG串联。本专利技术“双特异性抗体”是指拥有两个不同的抗原结合位点，能同时结合HER2和PD1的双特异性抗体，其包含两个单链可变片段scFv和与之缀合的免疫球蛋白抗体IgG，每个scFv经由肽接头L2连接至IgG每条重链，形成双特异性抗体的重链融合蛋白，其中每个scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过肽接头L1连接。本专利技术“单链可变区片段scFv”是指包含免疫球蛋白重链VH和轻链VL可变区的融合蛋白，VH与VL通过肽接头相连，其中所述融合蛋白保留了完整免疫球蛋白相同的抗原特异性。本专利技术“免疫球蛋白抗体IgG”是约150kDa的分子，它由四条肽链构成，含有两条相同的约50kDa的γ重链，和两条相同的约25kDa的轻链，从而具有四聚体四级结构。两条重链通过二硫键相互连接，并各自与一条轻链连接。所成的四聚体具有相同的两半，二者形成叉型或者类似Y的形状，叉的每一端含有一个相同的抗原结合位点。IgG抗体可以基于重链的恒定区中氨基酸序列的微小差异而分为多个亚类(例如IgG1、2、3、4)。作为优选的方案，所述VH包含互补决定区HCDR1-3，其中HCDR1的氨基酸序列为SEQIDNO：1，HCDR2的氨基酸序列为SEQIDNO：2，HCDR3的氨基酸序列为SEQIDNO：3；所述VL包含互补决定区LCDR1-3，其中LCDR4的氨基酸序列为SEQIDNO：4，LCDR5的氨基酸序列为SEQIDNO：5，LCDR6的氨基酸序列为SEQIDNO：6；所述IgG的重链包含互补决定区HCDR4-6，其中HCDR4的氨基酸序列为SEQIDNO：7，其中HCDR5的氨基酸序列为SEQIDNO：8，其中HCDR6的氨基酸序列为SEQIDNO：9；所述IgG的轻链包含互补决定区LCDR4-6，其中LCDR4的氨基酸序列为SEQIDNO：10，其中LCDR5的氨基酸序列为SEQIDNO：11，其中LCDR6的氨基酸序列为SEQIDNO：12。本领域中，抗体的结合区通常均含有一条轻链可变区和一条重链可变区，每一个可变区均含有3个CDR结构域。抗体的重链和轻链的CDR结构域分别称为HCDR和LCDR。因此，常规抗体抗原结合位点包含六个CDR，包括分别来自重链和轻链V区的CDR集合。作为优选的方案，scFv的VH的氨基酸序列为SEQIDNO：13，VL的氨基酸序列为SEQIDNO：14；所述IgG的重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：15，轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：16。作为优选的方案，所述肽接头L1的氨基酸序列为SEQIDNO：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体，其特征在于，其包含免疫球蛋白抗体IgG和两个相同的单链可变片段scFv，其中每个scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过肽接头L1连接，每个scFv通过接头肽L2与IgG串联。/n

【技术特征摘要】
1.一种能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体，其特征在于，其包含免疫球蛋白抗体IgG和两个相同的单链可变片段scFv，其中每个scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过肽接头L1连接，每个scFv通过接头肽L2与IgG串联。


2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述VH包含互补决定区HCDR1-3，其中HCDR1的氨基酸序列为SEQIDNO：1，HCDR2的氨基酸序列为SEQIDNO：2，HCDR3的氨基酸序列为SEQIDNO：3；
所述VL包含互补决定区LCDR1-3，其中LCDR4的氨基酸序列为SEQIDNO：4，LCDR5的氨基酸序列为SEQIDNO：5，LCDR6的氨基酸序列为SEQIDNO：6；
所述IgG的重链包含互补决定区HCDR4-6，其中HCDR4的氨基酸序列为SEQIDNO：7，其中HCDR5的氨基酸序列为SEQIDNO：8，其中HCDR6的氨基酸序列为SEQIDNO：9；
所述IgG的轻链包含互补决定区LCDR4-6，其中LCDR4的氨基酸序列为SEQIDNO：10，其中LCDR5的氨基酸序列为SEQIDNO：11，其中LCDR6的氨基酸序列为SEQIDNO：12。


3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，VH的氨基酸序列为SEQIDNO：13，VL的氨基酸序列为SEQIDNO：14；
所述IgG的重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：15，轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：16。


4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述肽接头L1的氨基酸序列为SEQIDNO：17。


5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述肽接头L2的氨基酸序列为SEQIDNO：18。


6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单链可变片段scFv的分子结构形式为VL-L1-VH，每个scFv的N末端经由肽接头L2连接至IgG重链的C末端。


7.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单链可变片段scFv的氨基酸序列为SEQIDNO：19。


8.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的重链氨基酸序列为SEQIDNO：20，其轻链氨基酸序列为SEQIDNO：21。


9.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1-8任一所述的双特异性抗体。


10.如权利要求9所述的核苷酸分子，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱祯平，黄浩旻，顾昌玲，
申请(专利权)人：三生国健药业上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31