抗EGFR/PD-1双特异性抗体制造技术

本发明专利技术属于肿瘤治疗领域，公开了一种抗EGFR/PD‑1双特异性抗体、制备方法和在抗肿瘤中的应用。更具体地，单链可变片段scFv和免疫球蛋白抗体IgG通过肽接头L2连接获得了具有类似全抗体结构和功能的双特异性抗体，该双特异性抗体具有靶向肿瘤表面抗原EGFR和激活肿瘤免疫的功能，同时能有效发挥抗体Fc段的ADCC功能。和单克隆抗体相比，该分子具有明显的协同效应，并且抗肿瘤效果优于抗体联用。

Anti EGFR / PD-1 bispecific antibody

【技术实现步骤摘要】
抗EGFR/PD-1双特异性抗体
本专利技术属于肿瘤治疗和生物
，涉及一种抗EGFR和PD-1的双特异性抗体分子制备方法和用途。
技术介绍
EGFR(EpidermalGrowthFactorReceptor)是表皮生长因子(EGF)的受体，属于ErbB受体家族。EGFR是一种分子量为170KDa的跨膜糖蛋白，属于受体型酪氨酸激酶，在相关配体如EGF和转化生长因子-α(transforminggrowthfactorα,TGFα)的作用下，EGFR由单体转化为二聚体而被激活，从而进一步活化下游信号传导通路，调控细胞的增殖。大量研究表明，在大多数肿瘤如胶质细胞癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中存在EGFR的高表达或者异常表达。EGFR功能的异常与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移以及细胞凋亡的抑制有关。其功能的异常主要表现为两个方面：一是在肿瘤组织中的过度异常表达，二是EGFR突变体在肿瘤细胞中的持续性激活(不需要配体刺激或形成自循环刺激通路)。在结肠癌病人组织中，EGFR的表达率约为25-77％。相关临床数据表明，EGFR表达量的多少与肿瘤的恶性程度以及肿瘤患者的预后密切相关。Erbitux(Cetuximab,IMC-C225)是针对EGFR的人鼠嵌合单克隆抗体，特异性地与EGFR结合，竞争性阻断EFGR与其配体结合，从而抑制EGFR信号传导。Erbitux于2004年2月被批准上市，用于与伊立替康联合治疗EGFR阳性、伊立替康化疗无效的转移性结直肠癌和联合放疗用于治疗局部区域性早期头颈部鳞状细胞癌(squamouscellcarcinomaoftheheadandneck，SCCHN)。由三生国健自主研发的EGFR单克隆抗体是按照Erbitux的氨基酸序列、用CHO细胞表达系统进行表达、并用自主研发的细胞培养生产工艺得到的人鼠嵌合单克隆抗体。体内外生物学活性以及抗肿瘤活性研究显示，三生国健药业自主研发的EGFR单克隆抗体与阳性对照药Erbitux具有极其相似的生物学活性，且其生物学活性在某些方面略优于阳性对照药Erbitux。人程序性细胞死亡受体-1(PD-1)是由288个氨基酸组成的I型膜蛋白，胞外段为负责结合配体的Ig可变型(V-型)结构域，胞内段为负责结合信号转导分子的胞质尾区。PD-1胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体，分别为ITIM(免疫受体酪氨酸抑制作用模体)和ITSM(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。PD-1表达在已经激活的T淋巴细胞表面，它与配体PD-L1(程序性死亡受体-配体1，programmedcelldeath-Ligand1)和PD-L2(程序性死亡受体-配体2，programmedcelldeath-Ligand2)结合可以抑制T淋巴细胞的活性及相关的体内细胞免疫反应。大量研究表明，PD-1和PD-L1的相互作用不仅维持了体内免疫系统的平衡，也是导致PD-L1表达阳性的肿瘤细胞规避免疫监视的主要机制。通过阻断PD-1/PD-L1信号通路，能够激活免疫系统，促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤。(pembrolizμMab)是第一个上市的针对PD-1的人源化单克隆抗体，于2014年9月被FDA批准用于治疗黑色素瘤，至2018年获批的适应证包括：黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞癌、膀胱癌、胃癌和带有MSI-H或dMMR的实体肿瘤。(nivolμMab)是百时美施贵宝公司的一款PD-1单克隆抗体，于2014年12月获FDA批准上市，适应证包括：黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞癌、膀胱癌、结直肠癌和肝细胞癌。中国专利申请CN201710054783.5公开了一种由三生国健药业自主研发的全新的抗PD-1人源化单克隆抗体。体内外生物学活性以及抗肿瘤活性研究显示，三生国健药业研发的PD-1单克隆抗体的生物学活性介于阳性对照药Opdivo和Keytruda之间，在某些方面略优于阳性对照药Opdivo。双特异性抗体(bispecificantibody，BsAb)是指能同时结合两个(或多个)不同抗原表位的抗体分子。与传统的单克隆抗体相比，双特异性抗体具有独特的作用机制：1)双特异性抗体可以同时结合2个或多个不同的抗原分子或相同分子的不同表位，产生协同效应。而抗体联用往往不具备这种效应。2)介导细胞间的相互作用。双特异性抗体可分别结合到效应细胞和靶细胞上的两种抗原上，在效应细胞和靶细胞之间架起桥梁，促进细胞间的相互作用，例如介导免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此双特异性抗体具有传统单克隆抗体不具备的独特优势。本专利提供了一种能靶向肿瘤细胞表面分子EGFR和T淋巴细胞表面分子PD-1的双特异性抗体。和单克隆抗体相比，该双特异性抗体表现出协同效应，与抗体联用相比，该双特异性抗体抗肿瘤效果优于抗体联用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新的能与EGFR和PD-1特异结合的双特异性抗体，还提供了该双特异性抗体的制备方法和应用。因此，本专利技术的目的在于提供一种能与EGFR和PD-1特异结合的双特异性抗体；提供编码所述双特异性抗体的核苷酸分子；提供包含所述核苷酸分子的表达载体；提供所述表达载体的宿主细胞；提供所述双特异性抗体的制备方法；提供包含所述双特异性抗体的药物组合物；提供所述双特异性抗体在制备药物中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术一方面提供了一种能与EGFR和PD-1特异结合的双特异性抗体，其包含免疫球蛋白抗体IgG和两个相同的单链可变片段scFv，其中每个scFv包含可变区VH和可变区VL，VH通过肽接头L1连接至VL，每个scFv的C末端经由肽接头L2连接至IgG重链的N末端。本专利技术“双特异性抗体”是指拥有两个不同的抗原结合位点，能同时结合至EGFR和PD-1的双特异性抗体，其包含两个单链可变片段scFv和与之缀合的免疫球蛋白抗体IgG，每个scFv的C末端经由肽接头L2连接至IgG每条重链的N末端，形成双特异性抗体的重链融合蛋白，其中每个scFv包含可变区VH和可变区VL，VH通过肽接头L1连接至VL。本专利技术“单链可变片段scFv”是指包含免疫球蛋白重链VH和轻链VL可变区的融合蛋白，VH通过肽接头融合至VL，其中所述融合蛋白保留了完整免疫球蛋白相同的抗原特异性。本专利技术“免疫球蛋白抗体IgG”是约150kDa的分子，它由四条肽链构成，含有两条相同的约50kDa的γ重链，和两条相同的约25kDa的轻链，从而具有四聚体四级结构。两条重链通过二硫键相互连接，并各自与一条轻链连接。所成的四聚体具有相同的两半，二者形成叉型或者类似Y的形状，叉的每一端含有一个相同的抗原结合位点。IgG抗体可以基于重链的恒定区中氨基酸序列的微小差异而分为多个亚类(例如IgG1、2、3、4)。作为优选的方案，所述VH包含互补决定区HCDR1-3，其中HCDR1的氨基酸序列为SEQIDNO：1，HCDR2的氨基酸序列为SEQIDNO：2，HCDR3的氨基酸序列为SEQIDNO：3；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能与EGFR和PD-1特异结合的双特异性抗体，其特征在于，其包含免疫球蛋白抗体IgG和两个相同的单链可变片段scFv，其中每个scFv包含可变区VH和可变区VL，VH通过肽接头L1连接至VL，每个scFv的C末端经由肽接头L2连接至IgG重链的N末端。/n

【技术特征摘要】
1.一种能与EGFR和PD-1特异结合的双特异性抗体，其特征在于，其包含免疫球蛋白抗体IgG和两个相同的单链可变片段scFv，其中每个scFv包含可变区VH和可变区VL，VH通过肽接头L1连接至VL，每个scFv的C末端经由肽接头L2连接至IgG重链的N末端。


2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述VH包含互补决定区HCDR1-3，其中HCDR1的氨基酸序列为SEQIDNO：1，HCDR2的氨基酸序列为SEQIDNO：2，HCDR3的氨基酸序列为SEQIDNO：3；
所述VL包含互补决定区LCDR1-3，其中LCDR4的氨基酸序列为SEQIDNO：4，LCDR5的氨基酸序列为SEQIDNO：5，LCDR6的氨基酸序列为SEQIDNO：6；
所述IgG的重链包含互补决定区HCDR4-6，其中HCDR4的氨基酸序列为SEQIDNO：7，其中HCDR5的氨基酸序列为SEQIDNO：8,其中HCDR6的氨基酸序列为SEQIDNO：9；
所述IgG的轻链包含互补决定区LCDR4-6，其中LCDR4的氨基酸序列为SEQIDNO：10，其中LCDR5的氨基酸序列为SEQIDNO：11,其中LCDR6的氨基酸序列为SEQIDNO：12。


3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，VH的氨基酸序列为SEQIDNO：13，VL的氨基酸序列为SEQIDNO：14；
所述IgG的重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：15，轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：16。


4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述肽接头L1的氨基酸序列为SEQIDNO：17。


5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述肽接头L2的氨基酸序列为SEQIDNO：18。


6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单链可变片段scFv的氨基酸序列为SEQIDNO：19...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱祯平，黄浩旻，李理，
申请(专利权)人：三生国健药业上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31