一种治疗血液肿瘤合并HIV感染的双特异性嵌合抗原受体、基因、构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种治疗HIV感染合并血液肿瘤的双特异性嵌合抗原受体重组基因的构建方法及其应用，所述嵌合抗原受体由信号肽、HIV gp120抗原特异性单链抗体及抗CD19单链抗体依次连接，再和CD28跨膜区以及CD28胞内结构域(ICD)、4‑1BB共刺激结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域依次串联组成，或者所述嵌合抗原受体由信号肽、HIV gp120抗原特异性单链抗体和CD28跨膜区以及CD28‑ICD、4‑1BB共刺激结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域(第一CAR)和信号肽、抗CD19单链抗体和CD8跨膜区以及CD28‑ICD、4‑1BB共刺激结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域(第二CAR)，第一CAR和第二CAR依次并联组成。

A bispecific chimeric antigen receptor, gene, construction method and its application in the treatment of blood tumor with HIV infection

【技术实现步骤摘要】
一种治疗血液肿瘤合并HIV感染的双特异性嵌合抗原受体、基因、构建方法及其应用
本专利技术涉及医药生物领域，具体是指一种治疗血液肿瘤合并HIV感染的双特异性嵌合抗原受体、其编码基因、构建方法及其应用。
技术介绍
人体感染艾滋病病毒后，CD4+T淋巴细胞受到病毒攻击，导致机体免疫能力降低，易发生各种病毒感染或恶性肿瘤疾病，淋巴瘤就是其中一种。艾滋病相关淋巴瘤的发病风险是普通人群的165倍，恶性淋巴瘤是目前艾滋病患者主要死亡原因之一。根据肿瘤专科医师意见，采用内科治疗方案给予HIV合并恶性肿瘤疾病患者治疗，治疗方案给予抗肿瘤联合ART治疗；入院后给予协助患者完成各项常规检查后，根据患者病情、CD4+T淋巴细胞数、药敏试验结果等，给予患者免疫支持、对症、抗病毒、抗机会性感染、高效抗转录病毒治疗等，病症稳定后，给予患者化疗治疗，化疗药物包括：亚叶酸钙、氟尿嘧啶、顺铂、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、吉西他滨等，化疗2周为1疗程。在此基础上给予患者三维适形放射治疗，每周照射总剂量3000-4800cGy，1次/d，5次/周，共治疗4周为1疗程。现目前，临床中并无对HIV合并恶性肿瘤兼治的最佳方案与药物，一般根据患者实际病毒载量与CD4+T淋巴细胞计数给予对症治疗。若患者CD4+T淋巴细胞<200/μL，则需对患者先行对症治疗与高效抗逆转录病毒(HAART)治疗，不宜即刻接受抗癌化疗，待患者病情稳定后再给予化疗或放疗，避免抗癌药物加剧机体感染及对免疫系统的损伤。若患者CD4+T淋巴细胞>200/μL则可给予患者高效抗逆转录病毒(HAART)治疗同时给予抗癌治疗。高效抗逆转录病毒治疗(HAART)是HIV/AIDS治疗史上的第一次革命，其极大的降低了HIV/AIDS的发病率和病死率，显著延长了患者寿命，甚至降低了HIV的传播。但也面临着很多挑战：(1)患者必须终生服药，需付出昂贵的经济代价；(2)严重的毒副作用；(3)耐药毒株的出现；(4)更为重要的是cART不能彻底清除病毒，主要是因为药物仅对复制中的病毒有效，而对HIV在感染早期建立的潜伏性病毒“储藏库”(reservoir)是无效的。一旦抗逆转录病毒治疗中断，病毒储藏库中的整合前病毒再度激活，几乎所有患者体内病毒血症会迅速反弹。对淋巴瘤的治疗主要是化疗的方法，副作用大且容易复发，无可供使用的疗法。但HIV合并恶性肿瘤患者一般病情严重，患者免疫系统遭受严重损伤，病情进展较快，患者病死率较高，对此，如何选择有效的治疗方案已迫在眉睫。为了有效治疗血液肿瘤合并HIV感染患者，本专利技术提供一种治疗血液肿瘤合并HIV感染的双特异性嵌合抗原受体及其编码基因，其能够通过CAR-T疗法对血液肿瘤合并HIV感染患者的病情起到很好的缓解、减轻以及治愈的疗效，具有广阔的临床推广前景。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术第一目的是提供一种治疗血液肿瘤合并HIV感染的双特异性嵌合抗原受体，所述双特异性嵌合抗原受体中包含抗HIVgp120单链抗体和抗CD19单链抗体。本专利技术通过优化设计HIVgp120、CD19特异的单链抗体，提供了一种HIVgp120、CD19双靶点修饰的CAR-T细胞，能够特异地与HIVgp120抗原及CD19结合。在HIV感染和CD19阳性B淋巴细胞系恶性肿瘤的细胞杀伤试验中，采用HIVgp120、CD19双靶点修饰的CAR-T细胞进行CAR-T疗法能实现一种CAR-T细胞杀伤两种不同类型恶性细胞，实现一种CAR-T同时治疗两种疾病的效果。进一步地，所述双特异性嵌合抗原受体还包括CSF2RA信号肽和CD8信号肽、CD28跨膜区和CD8跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号转导结构域。进一步地，所述双特异性嵌合抗原受体从N端到C端顺次拼接信号肽SP1、抗HIVgp120单链抗体、StrepII、连接肽、抗CD19单链抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ胞内信号传导结构域。进一步地，所述双特异性嵌合抗原受体从N端到C端由第一CAR：信号肽SP1、抗HIVgp120抗原特异性单链抗体、StrepII、连接肽和CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ胞内信号传导结构域和第二CAR：信号肽SP2、抗CD19单链抗体、CD8跨膜区、CD28-ICD以及CD3ζ胞内信号传导结构域，第一CAR和第二CAR通过P2A依次并联组成。更进一步地，所述信号肽优选为CSF2RA和CD8信号肽；所述连接肽为3×G4S；所述自切割短肽优选为P2A类短肽。本专利技术还提供双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸。进一步地，所述双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO：37或如SEQIDNO：38所示。本专利技术第三目的是提供一种重组慢病毒载体，所述慢病毒载体以PTK881-EF1α载体为骨架，含有前述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸。本专利技术第四目的是提供一种免疫细胞，所述免疫细胞转染有前述的重组慢病毒载体。本专利技术第五目的是提供一种双特异性嵌合抗原受体编码核苷酸的构建方法。进一步地，所述构建方法包括以下步骤：1)基因合成如SEQIDNO：1所示的信号肽-抗HIVgp120单链抗体编码核苷酸SP1-N6，以及如SEQIDNO：2所示的信号肽-抗CD19单链抗体编码核苷酸SP2-FMC83-28Z，将合成的上述编码核苷酸分别克隆至pUC57载体；2)以人cDNA文库为模板，设计引物分别扩增片段CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域(ICD)、4-1BB共刺激结构域、CD8跨膜区、CD3ζ胞内信号传导结构域、以引物互补方式得到StrepII、连接肽3×G4S、P2A；3)采用OverlapPCR技术将SP1-N6、StrepII、连接肽3×G4S、SP2-FMC63-28Z与CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域顺次扩增连接，获得嵌合抗原受体的编码基因C5-CAR，其结构示意图如图1所示；采用OverlapPCR技术分别将SP1-N6与StrepII、连接肽3×G4S、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域顺次扩增成片段SP1-CD3ζ，P2A与SP2-FMC63-28Z、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28-ICD、CD3ζ胞内信号传导结构域顺次扩增成片段P2A-SP2-CD3ζ，片段SP1-CD3ζ与P2A-SP2-CD3ζ最后连接成编码基因C6-CAR，其结构示意图如图2所示；优选地，所述单链抗体N6的氨基酸序列如SEQIDNO：35所示、所述单链抗体FMC63-28Z的氨基酸序列如SEQIDNO：36所示，信号肽SP1、信号肽SP2、StrepII、连接肽3×G4S的核苷酸序列分别如SEQIDNO：7、9、11、23所示；C5-CA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗HIV感染合并血液肿瘤的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述双特异性嵌合抗原受体中包含抗HIV gp120单链抗体和抗CD19单链抗体，进一步地，所述双特异性嵌合抗原受体还包括信号肽、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗HIV感染合并血液肿瘤的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述双特异性嵌合抗原受体中包含抗HIVgp120单链抗体和抗CD19单链抗体，进一步地，所述双特异性嵌合抗原受体还包括信号肽、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。


2.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述双特异性嵌合抗原受体从N端到C端顺次拼接信号肽SP1、抗HIVgp120单链抗体、StrepII、连接肽、抗CD19单链抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ胞内信号传导结构域。


3.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述双特异性嵌合抗原受体由第一CAR：信号肽SP1、抗HIVgp120抗原特异性单链抗体、StrepII、连接肽、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ胞内信号传导结构域和第二CAR：信号肽SP2、抗CD19单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28-ICD以及CD3ζ胞内信号传导结构域，第一CAR和第二CAR由自切割短肽依次并联组成。


4.根据权利要求2和3所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述信号肽优选为CD8信号肽和CSF2RA信号肽；所述连接肽为3×G4S；所述自切割短肽优选为P2A类短肽。


5.权利要求1-4任一项所述双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸，其特征在于：权利要求2所述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列如SEQIDNO：37所示；权利要求3所述的双特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列如SEQIDNO：38所示。


6.一种重组慢病毒载体，其特征在于：以PTK881-EF1α载体为骨架，含有权利要求5所述的编码核苷酸。


7.一种免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞转染有权利要求6所述的重组载体，优选地，所述免疫细胞为T细胞，更优选地，所述T细胞为健康供者γδT细胞和脐血来源的CD8+T细胞。


8.权利要求5所述编码核苷酸的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)基因合成如SEQIDNO：1所示的信号肽-抗HIVgp120单链抗体编码核苷酸SP1-N6，以及如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾潮江，张同存，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42