核酸检测微球、制备方法、试剂盒及高通量核酸检测方法技术

本申请提供一种核酸检测微球、制备方法、试剂盒及高通量核酸检测方法。所述核酸检测微球由具有荧光编码信息的核体和引物或探针的包裹层。多种核酸检测微球随机分布到由待检测样本核酸反应液生成的微液滴中。当温度升高到60摄氏度以上，包覆层融化，引物、探针释放到待检测样本核酸反应液中，从而组成完整的核酸扩增反应体系，荧光编码核体留在核酸扩增液中，作为标记微液滴的荧光标签。通过检测每个微液滴中的具有荧光编码信息的核体，筛选出有且只有一个核体的微液滴作为有效液滴进入后续的分析，获得有效微液滴中引物、探针种类。然后读取核酸扩增反应之后的报告荧光信号，获取有效微液滴中是否有相应的待检测目标核酸分子。

Nucleic acid detection microsphere, preparation method, kit and high-throughput nucleic acid detection method

【技术实现步骤摘要】
核酸检测微球、制备方法、试剂盒及高通量核酸检测方法
本申请涉及核酸检测分析领域，特别是涉及一种核酸检测微球、制备方法、试剂盒及高通量核酸检测方法。
技术介绍
近年来，PCR(DigitalPCR，dPCR)技术迅速发展。聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)，是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。PCR包括微滴式PCR检测方法和芯片式检测方法。微滴式PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个皮升或纳升级的微滴，其中，每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，检测微液滴，但是对于传统的PCR检测技术，只能检测有限的目标序列(与设备荧光通道数和设计的探针种类有关)。PCR检测如果要检测十几种、几十种或者上百种目标序列，则需要重复多次检测，增大了工作量，耗费大量样本，且时间工作效率低。
技术实现思路
基于此，有必要针对传统PCR检测技术不断反复的多次检测、工作量大且耗费时间的问题，提供一种可以实现高通量、高灵敏度、检测时间短的用于高通量核酸检测分析的核酸检测微球、制备方法、试剂盒及高通量核酸检测方法。本申请提供一种核酸检测微球，用于高通量核酸检测分析。所述核酸检测微球包括核体以及包覆层。所述核体具有荧光编码信息。所述包覆层包裹所述核体，所述包覆层包括基体以及分散于所述基体的引物，且所述引物与所述核体唯一对应。在其中一个实施例中，所述包覆层还包括探针，且所述探针与所述引物分散于所述基体，并与所述核体唯一对应。在其中一个实施例中，所述基体为琼脂糖凝胶。在其中一个实施例中，所述核体为含有荧光染料的实体球。在其中一个实施例中，所述核体的直径为10微米～100微米。在其中一个实施例中，所述包覆层厚度为10微米～100微米。在其中一个实施例中，一种核酸检测微球的制备方法，包括：S110，提供多个核体与引物溶液；S120，提供凝胶粉末，将所述凝胶粉末加入到双蒸水中获得凝胶粉溶液，并将所述凝胶粉溶液加热至澄清，获得包覆层制备液；S130，在凝胶熔融温度，将所述多个核体、所述引物溶液与所述包覆层制备液混合，获得核酸检测微球制备溶液；S140，在所述凝胶熔融温度，将所述核酸检测微球制备溶液微滴化，形成多个核酸检测微球液滴；S150，将所述多个核酸检测微球液滴冷却，并通过流式分选获得多个核酸检测微球。在其中一个实施例中，在所述步骤S150中，所述核酸检测微球为含有单个所述核体的核酸检测微球。在其中一个实施例中，在所述步骤S120中，所述凝胶粉末为琼脂粉或聚乙二醇双丙烯酸酯等。在其中一个实施例中，所述步骤S140包括：S141，提供具有出口端的吐液枪头，吐液枪头内储存有所述核酸检测微球制备溶液，且提供储存有疏水性油的开口容器；S142，在所述凝胶熔融温度，将所述吐液枪头的出口端插入所述疏水性油的液面下；S143，所述吐液枪头的出口端在所述疏水性油的液面下做瞬时加速的运动或变速周期的运动，将所述核酸检测微球制备溶液由所述吐液枪头的出口端排出，在所述疏水性油的液面下形成所述多个核酸检测微球液滴。在其中一个实施例中，一种核酸检测微球的制备方法，包括：S210，提供引物溶液、探针溶液以及多个核体；S220，提供凝胶粉末，将所述凝胶粉末加入到双蒸水中获得凝胶粉溶液，并将所述凝胶粉溶液加热至澄清，获得包覆层制备液；S230，在凝胶熔融温度，将所述多个核体、所述引物和探针溶液与所述包覆层制备液混合，获得核酸检测微球制备溶液；S240，在所述凝胶熔融温度，将所述核酸检测微球制备溶液微滴化，形成多个核酸检测微球液滴；S250，将所述多个核酸检测微球液滴冷却，并通过流式分选获得多个核酸检测微球。在其中一个实施例中，在所述步骤S250中，所述核酸检测微球为含有单个所述核体的核酸检测微球。在其中一个实施例中，一种试剂盒，用于高通量核酸检测分析。所述试剂盒包括如上述任一实施例中所述的核酸检测微球与核酸反应液。在其中一个实施例中，一种高通量核酸检测方法，包括：S310，提供核酸扩增反应液与多种不同类型的核酸检测微球，且所述核酸检测微球包括核体与包覆层，所述核体具有编码信息，所述包覆层包裹所述核体，所述包覆层包括基体以及分散于所述基体的引物，且所述引物与所述核体唯一对应，所述核体为含有荧光染料的实体球；S320，将所述多种不同类型的核酸检测微球与所述核酸扩增反应液混合，获得核酸检测液；S330，将所述核酸检测液微滴化，形成多个微液滴；S340，将所述多个微液滴进行核酸扩增，获得扩增完成后的所述多个微液滴；S350，根据扩增完成后的所述多个微液滴，检测每个所述微液滴中的所述核体，筛选出仅含有一个所述核体的所述微液滴，获得第一有效微液滴；S360，根据所述第一有效微液滴，检测所述第一有效微液滴中的所述核体的荧光编码信号，获得所述核体对应的所述引物，并读取核酸扩增反应之后的报告荧光信号，获取所述有第一效微液滴中是否有对应的目标核酸分子。在其中一个实施例中，在所述步骤S310中，所述核酸扩增反应液为以脱氧核糖核酸为模板的核酸扩增反应液、以核糖核酸为模板的逆转录核酸扩增反应液或环介导等温扩增反应液，且所述核酸扩增反应液中包含荧光染料。在其中一个实施例中，所述步骤S360包括：S361，提供荧光信号检测装置，所述荧光信号检测装置包括编码荧光通道与荧光染料检测通道，根据编码荧光通道识别所述有效微液滴中所述核体的荧光编码信号；S362，根据所述核体的荧光编码信号，获取所述核体对应的所述引物；S363，根据所述荧光染料检测通道检测所述第一有效微液滴中核酸扩增反应之后的报告荧光信号，获取所述第一有效微液滴中是否有对应的目标核酸分子。在其中一个实施例中，一种高通量核酸检测方法，包括：S410，提供核酸扩增反应液与多种不同类型的核酸检测微球，且所述核酸检测微球包括核体与包覆层，所述核体具有编码信息，所述包覆层包裹所述核体，所述包覆层包括基体以及分散于所述基体的引物和探针，且所述引物和所述探针与所述核体唯一对应，所述核体为具有荧光编码信息的实体球；S420，将所述多种不同类型的核酸检测微球与所述核酸扩增反应液混合，获得核酸检测液；S430，将所述核酸检测液微滴化，形成多个微液滴；S440，将所述多个微液滴进行核酸扩增，获得扩增完成后的所述多个微液滴；S450，根据扩增完成后的所述多个微液滴，检测每个所述微液滴中的所述核体，筛选出仅含有一个所述核体的所述微液滴，获得第二有效微液滴；S460，根据所述第二有效微液滴，检测所述第二有效微液滴中的所述核体的荧光编码信号，获得所述核体对应的所述引物与所述探针，并读取核酸扩增反应之后的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸检测微球，用于高通量核酸检测分析，其特征在于，包括：/n核体，所述核体具有荧光编码信息；/n包覆层，包裹所述核体，所述包覆层包括基体以及分散于所述基体的引物，且所述引物与所述核体唯一对应。/n

【技术特征摘要】
1.一种核酸检测微球，用于高通量核酸检测分析，其特征在于，包括：
核体，所述核体具有荧光编码信息；
包覆层，包裹所述核体，所述包覆层包括基体以及分散于所述基体的引物，且所述引物与所述核体唯一对应。


2.如权利要求1所述的核酸检测微球，其特征在于，所述包覆层还包括探针，且所述探针与所述引物分散于所述基体，并与所述核体唯一对应。


3.如权利要求1所述的核酸检测微球，其特征在于，所述基体为琼脂糖凝胶。


4.如权利要求1所述的核酸检测微球，其特征在于，所述核体为含有荧光染料的实体球。


5.如权利要求1所述的核酸检测微球，其特征在于，所述核体的直径为10微米～100微米。


6.如权利要求1所述的核酸检测微球，其特征在于，所述包覆层厚度为10微米～100微米。


7.一种核酸检测微球的制备方法，包括：
S110，提供多个核体与引物溶液；
S120，提供凝胶粉末，将所述凝胶粉末加入到双蒸水中获得凝胶粉溶液，并将所述凝胶粉溶液加热至澄清，获得包覆层制备液；
S130，在凝胶熔融温度，将所述多个核体、所述引物溶液与所述包覆层制备液混合，获得核酸检测微球制备溶液；
S140，在所述凝胶熔融温度，将所述核酸检测微球制备溶液微滴化，形成多个核酸检测微球液滴；
S150，将所述多个核酸检测微球液滴冷却，并通过流式分选获得多个核酸检测微球。


8.如权利要求7所述的核酸检测微球的制备方法，其特征在于，在所述步骤S150中，所述核酸检测微球为含有单个所述核体的核酸检测微球。


9.如权利要求7所述的核酸检测微球的制备方法，其特征在于，在所述步骤S120中，所述凝胶粉末为琼脂粉、或聚乙二醇双丙烯酸酯等。


10.如权利要求7所述的核酸检测微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S140包括：
S141，提供具有出口端的吐液枪头，吐液枪头内储存有所述核酸检测微球制备溶液，且提供储存有疏水性油的开口容器；
S142，在所述凝胶熔融温度，将所述吐液枪头的出口端插入所述疏水性油的液面下；
S143，所述吐液枪头的出口端在所述疏水性油的液面下做瞬时加速的运动或变速周期的运动，将所述核酸检测微球制备溶液由所述吐液枪头的出口端排出，在所述疏水性油的液面下形成所述多个核酸检测微球液滴。


11.一种核酸检测微球的制备方法，包括：
S210，提供引物溶液、探针溶液以及多个核体；
S220，提供凝胶粉末，将所述凝胶粉末加入到双蒸水中获得凝胶粉溶液，并将所述凝胶粉溶液加热至澄清，获得包覆层制备液；
S230，在凝胶熔融温度，将所述多个核体、所述引物和探针溶液与所述包覆层制备液混合，获得核酸检测微球制备溶液；
S240，在所述凝胶熔融温度，将所述核酸检测微球制备溶液微滴化，形成多个核酸检测微球液滴；
S250，将所述多个核酸检测微球液滴冷却，并通过流式分选获得多个核酸检测微球。


12.如权利要求11所述的核酸检测微球的制备方法，其特征在于，在所述步骤S250中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛广济，
申请(专利权)人：思纳福北京医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11