一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针及其应用。所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针及其应用


[0001]本专利技术属于病原菌检测
，涉及一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针及其应用。

技术介绍

[0002]结核分枝杆菌复合群是一组基因组高度同源，可引起结核病的分枝杆菌，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等。其中结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌为引起人类结核病的主要病原菌。
[0003]现有检测以涂片镜检和培养的方式为主，涂片镜检敏感性低，且涂阴肺结核患者占肺结核患者一半左右，并且超过10%的结核疾病传播与涂阴肺结核有关；结核分枝杆菌培养时间长，很容易导致误诊、漏诊、潜在传播的风险。所以急需一种快速准确的诊断方法（分子生物学检测）进行诊断。但目前注册分子产品所用样本类型均为痰液、肺泡灌洗液等，而对于急重症患者、婴儿、儿童病例、无呼吸道病变的肺外结核病例等，难以获取足够的呼吸道标本进行检测，因此结核病游离DNA检测应运而生。游离DNA（cfDNA）作为新的生物标志物已经用于临床孕妇产前诊断、肿瘤检测、器官移植术后排斥和感染检测等领域，但血液中游离DNA含量一般较低，片段较小。因此高灵敏度数字PCR检测平台显示出了其检测优势。
[0004]例如CN112725486A公开了一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒及制备方法，此方法采用特异性基因位点IS1081和数字PCR相结合的方法对标准基因和样品基因能够大量的扩增，但此方法检测靶点单一，仅能针对基因位点IS1081进行检测，准确度较多基因靶点联合检测效果低。
[0005]CN109811036A公开了一种多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的方法，所述方法将体外核酸恒温扩增技术和纳米生物传感检测技术相结合，实现了对结核分枝杆菌复合群的特异基因IS1081和IS6110的检测，但是此方法仅能针对基因位点IS1081和IS6110进行检测，未能实现多基因联合检测，检测成本较高，操作复杂。
[0006]综上所述，亟需开发一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，进行多靶点联合检测，实现高精度、可重复、周期短和高灵敏度的检测结核分枝杆菌复合群。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针及其应用，能够联合检测IS6110、IS1081、GYRB和RPOB 4个基因检测位点，敏感性优于单基因IS6110检测，灵敏度和准确率高，特别适用于急重症、儿童、婴儿等取样困难患者，也可以用于涂片阴性、阳性或未能明确诊断患者的辅助检测，易操作。
[0008]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.8所示的序列，所述荧光探针的核酸序
列包括SEQ ID NO.9
‑
SEQ ID NO.12所示的序列。
[0010]本专利技术提供一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，能够联合检测IS6110、IS1081、GYRB和RPOB 4个基因检测位点，敏感性提升到单靶点检测的1.5倍，灵敏度和准确率高，易操作。
[0011]SEQ ID NO.1：GGCGTACTCGACCTGAAAGA。
[0012]SEQ ID NO.2：CTGAACCGGATCGATGTGTA。
[0013]SEQ ID NO.3：TACCGCGAACGCAGCGAT。
[0014]SEQ ID NO.4：GCCAGTCCGGGAAATAGCTG。
[0015]SEQ ID NO.5：GACGTGGTGATGACACAACTACAT。
[0016]SEQ ID NO.6：CTTCGAGCCGGGTGGATAG。
[0017]SEQ ID NO.7：CTTCTCCGGGTCGATGTCG。
[0018]SEQ ID NO.8：TCCTTGTCTTTGCACTCGTCG。
[0019]SEQ ID NO.9：CCACCATACGGATAGGGGAT。
[0020]SEQ ID NO.10：CACCCGTGCCGCAACCATC。
[0021]SEQ ID NO.11：CGACTCGGACGCGTATGCGATATCT。
[0022]SEQ ID NO.12：TCGTTCTCTGACCCTCGTTTC。
[0023]优选地，所述荧光探针的5
’
端含有荧光基团，3
’
端含有淬灭基团。
[0024]优选地，所述荧光基团包括HEX、VIC、CY5或ROX中任意一种或至少两种的组合。
[0025]优选地，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或MGB中任意一种或至少两种的组合。
[0026]第二方面，本专利技术提供了第一方面所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针在制备用于检测结核分枝杆菌复合群的产品中的应用。
[0027]第三方面，本专利技术提供了一种检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针。
[0028]第四方面，本专利技术提供了第一方面所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针在检测结核分枝杆菌复合群中的应用。
[0029]第五方面，本专利技术提供了一种检测结核分枝杆菌复合群的方法，所述方法包括：
[0030]从待测样本中提取cfDNA作为模板，利用第一方面所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针进行多重液滴数字PCR扩增，根据PCR扩增结果进行判断。
[0031]游离DNA（cfDNA）可以替代组织或作为组织检测的补充，解决了传统的检测结核分枝杆菌复合群常用的标本为病理组织或细胞学标本，但是组织取材具有创伤性的缺陷，不受受到肿瘤大小和部位的影响，便于取样。
[0032]cfDNA检测结核分枝杆菌复合群仍存在一些挑战：（1）血浆cfDNA含量因人而异，并且大多数人含量较低；（2）cfDNA片段较短，最大约为180 bp；（3）cfDNA中来自于肿瘤细胞的cfDNA含量大多处于1%以下，甚至只能占总cfDNA的万分之一所以对检测技术的灵敏度、特异性要求比较高。本专利技术采用数字PCR检测方法，设计了特异性引物探针，控制最大上样量，实现了cfDNA样本用量低至10 ng/孔，解决了临床cfDNA样本量少的难题，同时能够精确定量。
[0033]优选地，所述多重液滴数字PCR扩增的方法包括：
[0034]（1）反应体系配置、分装至8联排中；
[0035]（2）模板投入；
[0036]（3）震荡混匀、上机检测；
[0037]（4）设置检测程序。
[0038]优选地，步骤（1）中所述反应体系包括PCR缓冲液、dN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，其特征在于，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.8所示的序列；所述荧光探针的核酸序列包括SEQ ID NO.9
‑
SEQ ID NO.12所示的序列。2.权利要求1所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针在制备用于检测结核分枝杆菌复合群的产品中的应用。3.一种检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针。4.权利要求1所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针在检测结核分枝杆菌复合群中的应用。5.一种检测结核分枝杆菌复合群的方法，其特征在于，所述方法包括：从待测样本中提取cfDNA作为模板，利用权利要求1所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针进行多重液滴数字PCR扩增，根据PCR扩增结果进行判断。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多重液滴数字PCR扩增的方法包括：（1）反应体系配置、分装至8联排中；（2）模板投入；（3）震荡混匀、上机检测；（4）设置检测程序；步骤（1）中所述反应体系包括PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨康，李修春，李海龙，况丽莎，
申请(专利权)人：思纳福北京医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：