本发明专利技术提供了一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒。本发明专利技术根据新型冠状病毒2019‑nCoV的ORF1ab基因、E基因、N基因、S基因和M基因设计特异性引物和探针，用于新冠病毒的鉴别检测。本发明专利技术检测2019‑nCoV的特异性引物/探针和试剂盒，灵敏度、精密度、准确度高，特异性好，稳定性好，检测所需模板量少，检测结果客观准确。五靶标设计能够更好的克服RNA病毒传代过程变异导致的假阴性，可有效提升阳性检出率，尽可能避免漏检的情况出现。具有较高的临床应用价值。
Detection novel coronavirus primers, probes and kit
【技术实现步骤摘要】
一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒
本专利技术涉及病毒检测领域，更具体地，涉及一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒。
技术介绍
核酸检验（RT-PCR）是新冠肺炎诊断的“金标准”。国家药品监督管理局应急审批首批7家企业的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒【一文读懂新型冠状病毒的核酸检测,国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心,中国医药报,2020-2-11第002版】，批准产品均基于新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b（Openreadingframe1ab，ORF1ab）、包膜蛋白（Envelopeprotein，E）和核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein，N）三个基因设计。但病毒的进化非常迅速【BartoszewiczJM,SeidelA,RenardBY.Interpretabledetectionofnovelhumanvirusesfromgenomesequencingdata[J].BioRxiv,2020.】，通过对序列的比对和文献检索，可以发现，ORF1ab基因已经发现相关SNP位点突变，编码结构蛋白的基因（如，S、E、M和N）在β冠状病毒属中表现高度保守性，但E基因与蝙蝠物种高度同源，针对E基因的引物探针很难或不能与这两个物种进行区分。中国科学院主办的《国家科学评论》（NationalScienceReview）于3月3日发表论文《关于SARS-CoV-2的起源和持续进化》（OntheoriginandcontinuingevolutionofSARS-CoV-2），中国科研团队最新发现显示：新冠病毒已于近期产生了149个突变点。一份发表在病毒学国际交流平台，由巴西AdolfoLutz国家研究所、国家参考实验室，以及圣保罗大学、牛津大学热带医学研究所共同完成的题为《FirstreportofCOVID-19inSouthAmerica》的研究首次分析了南美洲新冠病毒的基因序列，初步的遗传分析表明，这株巴西“Brazil/SPBR1/2020”病毒的基因组，跟中国此前公布的“Hu-1参考株”有3处不同，表示病毒在传播的过程中已经开始突变。因此，目前核酸检测在应用中准确性遭到质疑。一些流行病学史、临床症状吻合，甚至CT显示肺部病毒感染的病患未能得到核酸“阳性”确诊。有学者认为现有核酸检测对于阳性病人，最高30～50%的阳性率。新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南中推荐检测ORF1ab和N基因，检测阳性判断要求两个基因均为阳性；在检测方法的局限性中强调不能排除因病毒变异导致的假阴性可能。AiJW【AiJW,ZhangHC,XuT,etal.Optimizingdiagnosticstrategyfornovelcoronaviruspneumonia,amµlti-centerstudyinEasternChina[J].medRxiv,2020.】认为RT-PCR有15%假阴性率，建议设计RT-PCR时建议扩增超过1个基因靶标分析。综上，在新冠疫情全面爆发的当下，亟需一种特异性强、准确率高用于检测新型冠状病毒的寡核苷酸组合物及其检测试剂盒和应用。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种检测新型冠状病毒的RT-PCR试剂盒，该试剂盒包含ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因和M基因的特异性引物；所述ORF1ab基因的特异性引物序列如SEQIDNO:1~2所示，所述N基因的特异性引物序列如SEQIDNO:4~5所示，所述E基因的特异性引物序列如SEQIDNO:7~8所示，所述S基因的特异性引物序列如SEQIDNO:10~11所示，所述M基因的特异性引物序列如SEQIDNO:13~14所示。优选地，所述试剂盒还包含ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因和M基因的探针；所述ORF1ab基因的探针序列如SEQIDNO:3所示，所述N基因的探针序列如SEQIDNO:6所示，所述E基因的探针序列如SEQIDNO:9所示，所述S基因的探针序列如SEQIDNO:12所示，所述M基因的探针序列如SEQIDNO:15所示。优选地，所述试剂盒的反应体系为：2×OneStepRT-PCRBufferIII10ul，5U/ulTakaraExTaqHS0.4ul，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.4ul，10uMForwardPrimer0.4ul，10uMReversePrimer0.4ul，Probe0.8ul，TotalRNA2ul，RNaseFreedH2O5.6ul。优选地，所述试剂盒的反应条件为：55℃15min，1个循环；95℃30s，1个循环；95℃10s；55℃30s，10个循环；95℃10s；55℃30s，35个循环。一种检测新型冠状病毒ORF1ab基因的RT-PCR特异性引物，其序列如SEQIDNO:1~2所示。一种检测新型冠状病毒ORF1ab基因的RT-PCR探针，其序列如SEQIDNO:3所示。一种检测新型冠状病毒N基因的RT-PCR特异性引物，其序列如SEQIDNO:4~5所示。一种检测新型冠状病毒N基因的RT-PCR探针，其序列如SEQIDNO:6所示。一种检测新型冠状病毒E基因的RT-PCR特异性引物，其序列如SEQIDNO:7~8所示。一种检测新型冠状病毒E基因的RT-PCR探针，其序列如SEQIDNO:9所示。一种检测新型冠状病毒S基因的RT-PCR特异性引物，其序列如SEQIDNO:10~11所示。一种检测新型冠状病毒S基因的RT-PCR探针，其序列如SEQIDNO:12所示。一种检测新型冠状病毒M基因的RT-PCR特异性引物，其序列如SEQIDNO:13~14所示。一种检测新型冠状病毒M基因的RT-PCR探针，其序列如SEQIDNO:15所示。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术发现新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因、E基因、N基因、S基因和M基因具较强保守性，并根据该5基因特异性的设计引物和探针，用于新型冠状病毒的鉴别检测。本专利技术检测试剂盒除检测ORF1ab、E和N基因外，增加了表面糖蛋白（S）和膜糖蛋白（M）基因的检测，通过五靶标联合检测，综合判断，能够提高RT-PCR方法检测新型冠状病毒的准确性。本专利技术检测新型冠状病毒2019-nCoV的特异性引物探针和试剂盒，灵敏度、精密度、准确度高，特异性好，稳定性好，检测所需模板量少，检测结果客观准确。五靶标（包括ORF1ab、N、E、S和M基因）设计能够更好的克服RNA病毒传代过程变异导致的假阴性，可有效提升阳性检出率，尽可能避免漏检的情况出现，具有较高的临床应用价值。附图说明图1为多种冠状病毒靶基因序列比对结果。其中，框内标示为引物、探针的结合位点。图2为ORF1ab基因不同引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测新型冠状病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因和M基因的特异性引物；/n所述ORF1ab基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:1~2所示，所述N基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:4~5所示，所述E基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:7~8所示，所述S基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:10~11所示，所述M基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:13~14所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测新型冠状病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因和M基因的特异性引物；
所述ORF1ab基因的特异性引物序列如SEQIDNO:1~2所示，所述N基因的特异性引物序列如SEQIDNO:4~5所示，所述E基因的特异性引物序列如SEQIDNO:7~8所示，所述S基因的特异性引物序列如SEQIDNO:10~11所示，所述M基因的特异性引物序列如SEQIDNO:13~14所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因和M基因的探针；所述ORF1ab基因的探针序列如SEQIDNO:3所示，所述N基因的探针序列如SEQIDNO:6所示，所述E基因的探针序列如SEQIDNO:9所示，所述S基因的探针序列如SEQIDNO:12所示，所述M基因的探针序列如SEQIDNO:15所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含反应液A、反应液B、反应液C和阴性质控品、2019-nCoV阳性质控品，所述反应液A含有SEQIDNO:1~3所示的ORF1ab基因的特异引物和探针、SEQIDNO:4~6所示的N基因的特异引物和探针、SEQIDNO:7~9所示的E基因的特异引物和探针，所述反应液B含有SEQIDNO:10~12所示的S基因特异引物和探针、SEQIDNO:13~15所示的M基因特异引物和探针，反应液C为酶溶液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：
2×OneStepRT-PCRBufferIII10ul，
5U/ulTakaraExTaqHS0.4ul，
PrimeScriptRTEnzymeMixII0.4ul，
10uMForwardPrimer0.4ul...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈绍宇，何瑰，李楚明，刘慧，李灵鸽，黄颖，
申请(专利权)人：广州安必平医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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