西吡氯铵在抗分枝杆菌感染的潜在应用，本发明专利技术提供了一种针对分枝杆菌中的肽脱甲酰基酶(peptide deformylase,PDF)的化合物，该化合物为西吡氯铵，对分枝杆菌中的肽脱甲酰基酶具有显著的抑制作用，因此本发明专利技术提供的化合物能够用来制备针对分枝杆菌中肽脱甲酰基酶的小分子抑制剂，有希望成为抗分枝杆菌感染的潜在药物。
【技术实现步骤摘要】
西吡氯铵在抗分枝杆菌感染的潜在应用
本专利技术涉及的是药学的
，具体的是西吡氯铵在抗分枝杆菌感染的应用。
技术介绍
3月24日是世界结核病日，是为了纪念RobertKoch教授在1882年在柏林发表了一项突破性的宣布，即他发现—结核分枝杆菌是结核病(Tuberculosis,TB)的原因[1]。至今结核病依然为世界上传染病死亡的头等原因[2]。由世界卫生组织全球结核病报告[2]的数据显示，在2017年，约有1000万人新患上结核病，其中约580万男性，320万女性和100万儿童。400万结核病患者仍未得到诊断和治疗。中国的结核病患者数量高居世界第二位，目前只低于印度。多重耐药结核病(multidrug-resistanttuberculosis,MDR-TB)和广泛耐药结核病(extensivelydrug-resistanttuberculosis,XDR-TB)的出现，使这一全球关注的问题达到了一个新的高度。2017年，新增的利福平耐药性结核病患者约有558,000例，其中82％为耐多药结核病(MDR)[2]。尽管采取了短程治疗策略，但大约有20％的结核病例对至少一种主要的抗结核药物具有耐药性，并且约有5％被归类为耐多药(MDR)或广泛耐药(XDR)[3],[4]。结核分枝杆菌的耐药菌株的传播可能会破坏控制结核病数十年的进展[5]。虽然一些新的抗分枝杆菌药物如贝达喹啉具有治疗某些耐药菌株的潜力，正在获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准，但最近的研究表明有耐药菌株的出现[6],[7],[8]。因此，结核病的治疗仍然是一个巨大的挑战，因为需要考虑个体和区域以及耐药性的情况。作为一种细菌蛋白质成熟的必需酶，肽脱甲酰酶(PDF)被认为是新一代抗菌药物的潜在且有前景的靶点[9-16]。在所研究的各种PDF抑制剂中，已发现放线菌素和BB-3497是针对各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的有效的PDF抑制剂，例如，金黄色葡萄球菌[17]和大肠杆菌[18]。根据报道，PDF抑制剂在体外条件下对牛分枝杆菌BCG具有活性，因为PDF基因在牛分枝杆菌BCG中是必需的[19]。然而，目前还没有报道表明这些抑制剂在离体或体内条件下对结核分枝杆菌的潜力。西吡氯铵，英文名是Cetylpyridiniumchloride，CAS号为123-03-5，是抗菌漱口水的活性成分，具有广谱抗菌性，对革兰氏阳性菌具有快速地杀菌作用，尤其是对酵母有较好的杀菌作用[20]。但是迄今为止，西吡氯铵在抗分枝杆菌感染的应用仍未见报道。
技术实现思路
针对相关技术的问题，本专利技术提供西吡氯铵在抗分枝杆菌感染中的应用。本专利技术而且还提供针对分枝杆菌中肽脱甲酰基酶的抑制剂。本专利技术所涉及西吡氯铵CAS号为123-03-5，购买于天津希恩思公司。通过设计实验发现：西吡氯铵对分枝杆菌的肽脱甲酰基酶有很好的抑制效果，该化合物有望作为抑制分枝杆菌感染的潜在药物。本专利技术提供的是一种用于预防或治疗分枝杆菌的肽脱甲酰基酶(MtPDF)感染的药物，其活性成分为西吡氯铵，该药物包含上述含有西吡氯铵以及一种或多种药学的载体。其药物所述载体包括药学领域常规的崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸附载体、润滑剂以及增效剂。还可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。这些药剂给药途径可为经皮、静脉、口服或肌肉注射。本专利技术具有的优点和积极效果是：本专利技术是针对分枝杆菌的肽脱甲酰基酶(MtPDF)的抑制剂，这种抑制剂名字为西吡氯铵。西吡氯铵对分枝杆菌中的肽脱甲酰基酶活性具有显著的抑制效果。附图说明图1是西吡氯铵对分枝杆菌的肽脱甲酰基酶的IC50示意图图2是西吡氯铵对M.Smegmatis、BCG、H37Ra的最小抑菌浓度实验结果数据表具体实施方式：1.分枝杆菌中的肽脱甲酰基酶(MtPDF)的分子构建(1)在网站https://mycobrowser.epfl.ch找到分枝杆菌的PDF酶的基因序列，在软件中进行引物设计，引物在金唯智公司合成。(2)PCR直接扩增目的基因，利用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。选择质粒pET-28a(+)作为其表达载体，重组载体邮送到金唯智公司进行测序。2.分枝杆菌中的肽脱甲酰基酶(MtPDF)的表达与纯化(1)将含有编码MtPDF基因的pET-28a(+)载体转化EscherichiacoliBL21(DE3)的菌株，并选用含卡那霉素的LB平板培养基筛选阳性的克隆。(2)在平板上挑取阳性克隆，培养过夜后转入液体的LB培养基，当液体培养基在600nm波长处的吸光值达到0.6，加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)在20℃继续培养。(3)用5000rpm离心10min收集细胞后高压破菌；破菌液离心后收集上清。(4)将上面的清液加入破菌buffer预平衡过的Ni-NTA亲和层析柱，使其与介质能够充分结合。(5)用20-400mM咪唑的buffer梯度洗脱蛋白，再利用凝胶过滤层析进行分离，得到纯度高的目的蛋白。3.MtPDF的活性测定测活原理：PDF使三肽fMAS(甲酰基-甲硫氨酸-丙氨酸-丝氨酸)脱去甲酰基，暴露出游离的氨基与TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)形成中间络合物，在酸性条件下340nm处有吸收，测其吸光度即可。在96孔平板加入测活buffer溶解的PDF酶和底物fMAS，共10uL反应30分钟，加10uL的4％的高氯酸终止反应，再加入50uL的0.01％的TNBS(0.1MNaHCO3溶解)，避光孵育2h，再加入10％SDS，最后加入1NHCl,使用仪器ThermoMultiskanFC测340nm下的吸光度。空白实验组：只有底物和1uL的DMSO(二甲基亚砜)。实验组：加PDF酶、底物和1uL的DMSO。抑制剂实验组：加PDF酶、底物和1uL西吡氯铵。其他条件用量不变。抑制率的计算式如下：△C1＝实验组-空白组，△C2＝抑制剂组-空白组，则抑制率(％)＝(△C1-△C2)/△C1x100％。多次实验得到抑制率均在90％以上。4.MtPDF的抑菌实验可以用刃天青微孔板法测定抑制剂对耻垢分枝杆菌(M.Smegmatis)的最小抑菌浓度。首先，进行菌液的培养，在超净台中按照1:200的比例，把MC2155的甘油菌加入7H9培养基，37℃220rpm振荡培养，至OD600＝1.0。在超净台中转接种子液，其比例是1：100，到5mL7H9液体培养基中，继续培养至OD600＝0.5。然后取少许菌液将其调整到OD600＝0.15，稀释100倍以备实验的使用。然后，稀释化合物，实验中以利福平作为阳性对照，分别梯度稀释利福平和西吡氯铵。在96孔板中，首先加入40uL的含有Tween-80与ADS的7H9液体培养基，设置3个药物平行，每一行加2uL药物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.西吡氯铵在抗分枝杆菌感染中的应用。/n
【技术特征摘要】
1.西吡氯铵在抗分枝杆菌感染中的应用。
2.西吡氯铵为分枝杆菌肽脱甲酰基酶的小分子抑制剂。
3.西吡氯铵的结构式是：
。
4.一种抗分枝杆菌感染的药物，其特征在于它包含权利要求1或2所述的西吡氯铵以及一...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨海涛，张翅，刘祥，王泽方，陈成，蔡岩，常晓娟，
申请(专利权)人：天津国际生物医药联合研究院，
类型：发明
国别省市：天津;12
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