一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法技术

本发明专利技术目的在于提供一种可以同时准确测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法。所述方法包括：(1)替代基质的选择；(2)对照基质中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的确定(3)工作曲线样品的制备及前处理；(4)质控样品的制备及前处理；(5)分离分析条件；(6)采用内标法，以系列皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮在替代基质中的浓度为横坐标，皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮分别与内标地塞米松的峰面积比为纵坐标，通过使用权重因子1/x2，线性回归得到理论浓度与响应之间的线性关系进行定量。

A method for simultaneous determination of endogenous cortisol, corticosterone, androstenedione and testosterone in human plasma by LC-MS

【技术实现步骤摘要】
一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法
本专利技术属于医药检测
，特别涉及一种测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法。
技术介绍
性激素是主要的甾体类激素，是一类脂溶性小分子激素，由胆固醇经一系列酶催化而来，是身体发育、性成熟及新陈代谢所必须的，在维持各项生命活动、调节机体物质代谢等方面发挥重要作用(参考文献：1.AndreuFabregat,AristotelisKotronoulas,JosepMarcos,etal.Detection,synthesisandcharacterizationofmetabolitesofsteroidhormonesconjugatedwithcysteine.Steroids,2013,78:327-336.)。临床上常通过性激素水平来了解妇科内分泌及相关生殖疾病，异常子宫出血、闭经、不孕症、妇科相关肿瘤等，因此，性激素不仅可作为治疗药物进行研究，还可以作为此类抗肿瘤药物治疗效果的生物标志物进行研究。但是，性激素作为内源性物质，能否准确定量是检测的难点。本专利技术基于替代基质法，建立了一种科学、快速和准确的液质联用测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法，本专利技术所述的方法可以用于准确、简便和快速地评价患者治疗的体内药效。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：(1)替代基质的选择本专利技术使用“相对加标回收率”法，来筛选合适的替代基质。以生理盐水配制3％BSA溶液考察替代基质的加标回收率；用475μL代替基质/对照基质加入25.0μL稀释剂/W-GMQC/W-MQC/W-HQC工作液，混合均匀后，各分装4份100μL；每份加入15.0μL的内标工作液，再加入400μL的乙酸乙酯进行萃取，离心后取200μL上清液，再氮气下吹干，加入150μL的50％甲醇水溶液复溶，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。结果代入相对加标回收率进行计算，相对加标回收率接受标准：三个浓度的相对加标回收率在85％～115％之间，且％CV不超过15％。计算公式如下：％相对加标回收率＝(spikedSM–blankSM)/(spikedSM–blankSM)spikedSM＝加标代替基质中分析物与内标的峰面积比值blankSM＝空白代替基质中分析物与内标的峰面积比值spikedCM＝加标对照基质中分析物与内标的峰面积比值spikedCM＝空白对照基质中分析物与内标的峰面积比值结果发现内标地塞米松和皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮在3％BSA生理盐水溶液与人血浆样品中的质谱响应基本趋于一致，三个浓度的相对加标回收率在90％-115％之间，且变异系数均不超过15％。故选择3％BSA生理盐水溶液作为代替基质进行人血浆中皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮的方法学验证试验及样品分析试验。(2)对照基质(人血浆)中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的确定标准曲线样品配制：用3％BSA生理盐水为替代基质配制标准曲线样品。分别取皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮储备液适量，用50％甲醇水稀释成为皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为4.00、8.00、40.0、200、400、1200、1800、2000ng/mL和皮质醇浓度为160、320、800、2400、4800、9600、14400、16000ng/mL的系列工作液；然后将上述两套工作液按对应的浓度点进行等体积混合，最后得到配制标准曲线样品所需的标准曲线工作液，其中皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为2.00、4.00、20.0、100、200、600、900和1000ng/mL；皮质醇浓度为80.0、160、400、1200、2400、4800、7200和8000ng/mL；向285μL的3％BSA生理盐水(替代基质)中分别加入15.0μL的上述用于标准曲线配制的系列工作溶液，配制成相当于皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为0.100ng/mL、0.200ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.0ng/mL、30.0ng/mL、45.0ng/mL、50.0ng/mL和皮质醇浓度为4.00ng/mL、8.00ng/mL、20.0ng/mL、60.0ng/mL、120ng/mL、240ng/mL、360ng/mL、400ng/mL的样品，分装出2份，每份100μL；对照基质样品的配制：直接取100μL人血浆样品即可；生物样品的前处理：将上述标准曲线样品和对照基质样品，每份加入15.0μL的内标工作液，再加入400μL的乙酸乙酯进行萃取，离心后取200μL上清液，再氮气下吹干，加入150μL的50％甲醇水溶液复溶，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。选定6批次人血浆作为对照基质，按上述方法进行对照基质中内源皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的测定。6批次人血浆中内源皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮和睾酮的平均浓度分别为79.6ng/mL、1.94ng/mL、1.06ng/mL和1.70ng/mL。(3)标准曲线样品的制备及前处理内标工作液的配制：取地塞米松标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于甲醇中，得到最终浓度为1.00mg/mL的储备液；再用50％甲醇水溶液稀释成为200ng/mL的内标工作液；标准系列溶液的配制：分别取皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮标准品适量，用甲醇配制成浓度为1.00mg/mL的储备液；再用50％甲醇水稀释成为皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为4.00、8.00、40.0、200、400、1200、1800、2000ng/mL和皮质醇浓度为160、320、800、2400、4800、9600、14400、16000ng/mL的系列工作液；然后将上述两套工作液按对应的浓度点进行等体积混合，最后得到配制标准曲线样品所需的标准曲线工作液，其中皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为2.00、4.00、20.0、100、200、600、900和1000ng/mL；皮质醇浓度为80.0、160、400、1200、2400、4800、7200和8000ng/mL；工作曲线样品的前处理：向285μL的3％BSA生理盐水(替代基质)中分别加入15.0μL的上述用于标准曲线配制的系列工作溶液，配制成相当于皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为0.100、0.200、1.00、5.00、10.0、30.0、45.0、50.0ng/mL和皮质醇浓度为4.00、8.00、20.0、60.0、120、240、360、400ng/mL的样品，分装出2份，每份100μL；每份加入15.0μL的内标工作液，再加入400μL的乙酸乙酯进行萃取，离心后取200μL上清液，再氮气下吹干，加入150μL的50％甲醇水溶液复溶，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。(4)质控本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法，其特征在于，该方法包括：/n(1)替代基质的选择：选择3％BSA生理盐水溶液作为代替基质进行人血浆中皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮的方法学验证试验及样品分析试验；/n(2)对人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的确定：用所述步骤(1)确定的替代基质进行标准曲线样品的配制，然后对所用到的各批次的人血浆中的本底皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮的浓度进行测定，确定混合后的对照基质中皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮的平均浓度分别为79.6ng/mL、1.94ng/mL、1.06ng/mL、1.70ng/mL，用以计算实际的质控样品的理论浓度；/n(3)标准曲线样品的制备及前处理：包括内容溶液的配制、标准系列溶液的配制、工作曲线样品的前处理，其中，/n内标溶液的配制为取地塞米松标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于甲醇中，得到最终浓度为1.00mg/mL的储备液；再用50％甲醇水溶液稀释成为200ng/mL的内标工作液；/n标准系列溶液的配制为分别取皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮标准品适量，用甲醇配制成浓度为1.00mg/mL的储备液；再用50％甲醇水稀释成为皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为4.00、8.00、40.0、200、400、1200、1800、2000ng/mL和皮质醇浓度为160、320、800、2400、4800、9600、14400、16000ng/mL的系列工作液；然后将上述两套工作液按对应的浓度点进行等体积混合，最后得到配制标准曲线样品所需的标准曲线工作液，其中皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为2.00、4.00、20.0、100、200、600、900和1000ng/mL；皮质醇浓度为80.0、160、400、1200、2400、4800、7200和8000ng/mL；/n工作曲线样品的前处理为向285μL的替代基质中分别加入15.0μL的上述本步骤中用于标准曲线配制的系列工作溶液，配制成相当于皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为0.100ng/mL、0.200ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.0ng/mL、30.0ng/mL、45.0ng/mL、50.0ng/mL和皮质醇浓度为4.00ng/mL、8.00ng/mL、20.0ng/mL、60.0ng/mL、120ng/mL、240ng/mL、360ng/mL、400ng/mL的样品，分装出2份，每份100μL；每份加入15.0μL的内标工作液，再加入400μL的乙酸乙酯进行萃取，离心后取200μL上清液，再氮气下吹干，加入150μL的50％甲醇水溶液复溶，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；/n(4)质控样品的制备及前处理：包括标准系列溶液的配制、质控样品的前处理，其中，/n标准系列溶液的配制为分别取皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮标准品适量，分别用甲醇配制成浓度为1.00mg/mL的储备液；再用50％甲醇水稀释成为含皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为1600ng/mL的W1-HQC、800ng/mL的W1-MQC、80.0ng/mL的W1-GMQC1、40.0ng/mL的W1-GMQC2、12.0ng/mL的W1-LQC和皮质醇浓度为10000ng/mL的W2-HQC、6000ng/mL的W2-MQC、2000ng/mL的W2-GMQC、480ng/mL的W2-LQC的系列工作液；然后将上述两套工作液按对应的浓度点进行等体积混合，最后得到配制标准曲线样品所需的质控工作液：高浓度质控工作液W-HQC为W1-HQC与W2-HQC混合，皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为800ng/mL，皮质醇浓度为5000ng/mL；中浓度质控工作液W-MQC为W1-MQC与W2-MQC混合，皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为400ng/mL，皮质醇浓度为3000ng/mL；几何中浓度质控工作液W-GMQC为W1-GMQC1与W2-GMQC混合，皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为40.0ng/mL，皮质醇浓度为1000ng/mL；低浓度质控工作液W-LQC为W1-LQC与W2-LQC混合，皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为6.00ng/mL，皮质醇浓度为240ng/mL；/n质控样品的前处理：分别向665μL人空白血浆中加入35.0μL上述W1-GMQC2工作液、W-MQC工作液和W-HQC工作液，配制相对应的GMQC质控样品、MQC质控样品、HQC质控样品；取一定体积人血浆，再用替代基质分别稀释至接近低质控浓度和定量下限浓度，配制为LQC和LLOQ质控样品，每个质控样品分装出6份，每份100μL；每份加入15.0μL的内标工作液，再加入400μL的乙酸乙酯进行萃取，离心后取200μL上清液...

【技术特征摘要】
1.一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)替代基质的选择：选择3％BSA生理盐水溶液作为代替基质进行人血浆中皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮的方法学验证试验及样品分析试验；
(2)对人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的确定：用所述步骤(1)确定的替代基质进行标准曲线样品的配制，然后对所用到的各批次的人血浆中的本底皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮的浓度进行测定，确定混合后的对照基质中皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮的平均浓度分别为79.6ng/mL、1.94ng/mL、1.06ng/mL、1.70ng/mL，用以计算实际的质控样品的理论浓度；
(3)标准曲线样品的制备及前处理：包括内容溶液的配制、标准系列溶液的配制、工作曲线样品的前处理，其中，
内标溶液的配制为取地塞米松标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于甲醇中，得到最终浓度为1.00mg/mL的储备液；再用50％甲醇水溶液稀释成为200ng/mL的内标工作液；
标准系列溶液的配制为分别取皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮标准品适量，用甲醇配制成浓度为1.00mg/mL的储备液；再用50％甲醇水稀释成为皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为4.00、8.00、40.0、200、400、1200、1800、2000ng/mL和皮质醇浓度为160、320、800、2400、4800、9600、14400、16000ng/mL的系列工作液；然后将上述两套工作液按对应的浓度点进行等体积混合，最后得到配制标准曲线样品所需的标准曲线工作液，其中皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为2.00、4.00、20.0、100、200、600、900和1000ng/mL；皮质醇浓度为80.0、160、400、1200、2400、4800、7200和8000ng/mL；
工作曲线样品的前处理为向285μL的替代基质中分别加入15.0μL的上述本步骤中用于标准曲线配制的系列工作溶液，配制成相当于皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为0.100ng/mL、0.200ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.0ng/mL、30.0ng/mL、45.0ng/mL、50.0ng/mL和皮质醇浓度为4.00ng/mL、8.00ng/mL、20.0ng/mL、60.0ng/mL、120ng/mL、240ng/mL、360ng/mL、400ng/mL的样品，分装出2份，每份100μL；每份加入15.0μL的内标工作液，再加入400μL的乙酸乙酯进行萃取，离心后取200μL上清液，再氮气下吹干，加入150μL的50％甲醇水溶液复溶，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；
(4)质控样品的制备及前处理：包括标准系列溶液的配制、质控样品的前处理，其中，
标准系列溶液的配制为分别取皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮标准品适量，分别用甲醇配制成浓度为1.00mg/mL的储备液；再用50％甲醇水稀释成为含皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为1600ng/mL的W1-HQC、800ng/mL的W1-MQC、80.0ng/mL的W1-GMQC1、40.0ng/mL的W1-GMQC2、12.0ng/mL的W1-LQC和皮质醇浓度为10000ng/mL的W2-HQC、6000ng/mL的W2-MQC、2000ng/mL的W2-GMQC、480ng/mL的W2-LQC的系列工作液；然后将上述两套工作液按对应的浓度点进行等体积混合，最后得到配制标准曲线样品所需的质控工作液：高浓度质控工作液W...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋媛媛，吴昱，周振东，刘虹霞，郭晶晶，黎婕，
申请(专利权)人：南京希麦迪医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32