一种液质联用测定人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的方法技术

本发明专利技术目的在于提供一种可以准确测定人血浆中内源性1‑磷酸鞘氨醇(S1P)浓度的方法。本发明专利技术的方法突破了内源干扰检测的难点，并且具有专属性强、准确度和灵敏度较高的特性。本发明专利技术采用液质联用仪测定人血浆中内源性S1P的浓度，该方法包括：(1)替代基质的选择；(2)对照基质中内源性S1P浓度的确定；(3)工作曲线样品的制备及前处理；(4)质控样品的制备及前处理；(5)分离分析条件；(6)采用内标法，以系列S1P在替代基质中的浓度为横坐标，S1P与内标C17‑S1P的峰面积比为纵坐标，通过使用权重因子1/x2，线性回归得到理论浓度与响应之间的线性关系进行定量。

A method for the determination of endogenous sphingosine 1-phosphate in human plasma by LC-MS

【技术实现步骤摘要】
一种液质联用测定人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的方法
本专利技术属于医药检测
，特别涉及一种检测人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的方法。
技术介绍
鞘脂类研究是目前脂类研究的重点之一，鞘脂类在细胞信号转导中起重要作用，而鞘氨醇激酶(sphingosinekinase，SphK)可以调节鞘脂类的代谢。鞘氨醇激酶包含两种亚型(SphK1和SphK2)。研究表明，SphK1与肿瘤细胞增殖/存活、转移相关的信号通路有着更密切的联系(参考文献：1.Huwiler,A.,andU.Zangemeister.Targetingtheconversionofceramidetosphingosine1-phosphateasanovelstrategyforcancertherapy.CritRevOncolHematol,63.2(2007):150-159.2.Taha,TarekAssad,Y.A.Hannun,andL.M.Obeid.Sphingosinekinase:biochemicalandcellularregulationandroleindisease.JBiochemMolBiol,39.2(2006):113-131.)，SphK1通过催化鞘氨醇生成促分裂的1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate，S1P)，从而控制着细胞的生命周期。许多肿瘤组织中可以观察到SphK1的过表达(参考文献：3.Alshaker,etal.TherapeuticPotentialofTargetingSK1inHumanCancers.AdvancesinCancerResearch,117(2013):143-200.4.Heffernanstroud,LindaA.,andL.M.Obeid.SphingosineKinase1inCancer.AdvancesinCancerResearch,117(2013):201-235.)，高水平的SphK1是患者无进展生存期降低和总体预后不良的因素(参考文献：5.Zhang,ShaoDan,etal.Sphingosinekinase1isassociatedwithgastriccancerprogressionandpoorsurvivalofpatients.ClinicalCancerResearchAnOfficialJournaloftheAmericanAssociationforCancerResearch,15.4(2009):1393.6.Li,J.,etal.Clinicalsignificanceofsphingosinekinase-1expressioninhumanastrocytomasprogressionandoverallpatientsurvival.ClinicalCancerResearchAnOfficialJournaloftheAmericanAssociationforCancerResearch,14.21(2008):6996.)。基于相关研究，通过抑制SphK1的活性，可以降低细胞内S1P的含量，其下游的分子活化也受到了抑制，从而成为进行肿瘤治疗的新方法(参考文献：7.Kapitonov,Dmitri,etal.TargetingSphingosineKinase1InhibitsAktSignaling,InducesApoptosis,andSuppressesGrowthofHumanGlioblastomaCellsandXenografts.CancerResearch,69.17(2009):6915-6923.8.Guan,H.,etal.Sphingosinekinase1regulatestheAkt/FOXO3a/Bimpathwayandcontributestoapoptosisresistanceingliomacells.PlosOne,6.5(2011):e19946.9.Pchejetski,D.；Doumerc,N.；Golzio,M.；Naymark,M.；Teissie,J.；Kohama,T.；Waxman,J.；Malavaud,B.；Cuvillier,O.Chemosensitizingeffectsofsphingosinekinase-1inhibitioninprostatecancercellandanimalmodels.Mol.CancerTher,2008,7,1836-1845.)。因此，S1P可以作为此类抗肿瘤药物治疗效果的生物标志物进行研究。但是，S1P作为内源性物质，能否准确定量是检测的难点。本专利技术基于替代基质法，建立了一种科学、快速和准确的液质联用测定人血浆中内源性S1P浓度的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种液质联用测定人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇(S1P)浓度的方法，本专利技术所述方法可以用于准确、简便和快速地评价患者治疗的体内药效。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种液质联用测定人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇(S1P)浓度的方法，所述方法包括如下步骤：(1)替代基质的选择使用“相对加标回收率”法，来筛选合适的替代基质；以生理盐水配制1％BSA、3％BSA与5％BSA溶液考察不同代替基质的加标回收率；250μg/mL的S1P储备液用甲醇稀释为高浓度质控工作液(8000ng/mL)、中浓度质控工作液(5000ng/mL)和低浓度质控工作液(500ng/mL)的系列质控工作液，分别加入到替代基质和人血浆中，配制空白样品、低浓度质控样品、中浓度质控样品和高浓度质控样品，结果代入相对加标回收率进行计算，相对加标回收率接受标准：三个浓度的相对加标回收率在85％～115％之间，且％CV不超过15％。计算公式如下：％相对加标回收率＝(spikedSM–blankSM)/(spikedSM–blankSM)spikedSM＝加标代替基质中分析物与内标的峰面积比值blankSM＝空白代替基质中分析物与内标的峰面积比值spikedCM＝加标对照基质中分析物与内标的峰面积比值spikedCM＝空白对照基质中分析物与内标的峰面积比值结果发现内标C17-S1P在5％BSA生理盐水溶液与人血浆样品中的质谱响应趋于一致，三个浓度的相对加标回收率在100％左右，且变异系数小于10％。故选择5％BSA生理盐水溶液作为代替基质进行人血浆中1-磷酸鞘氨醇(S1P)的方法学验证试验及样品分析试验。(2)对照基质(人血浆)中内源性S1P浓度的确定标准曲线样品配制：用5％BSA生理盐水为替代基质配制标准曲线样品，用甲醇稀释250μg/mL的S1P储备液，配制浓度为200ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、5000ng/mL、7200ng/mL和8000ng/mL的系列标准曲线工作液；向380μL的5％BSA生理盐水(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液质联用测定人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的方法，其特征在于，该方法包括：/n(1)替代基质的选择：选择5％BSA生理盐水溶液作为替代基质进行人血浆中1-磷酸鞘氨醇的方法学验证试验及样品分析试验；/n(2)人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的确定：用步骤(1)中所述的替代基质进行标准曲线样品的配制，然后对人血浆中的本底1-磷酸鞘氨醇的浓度进行测定，确定混合后的人血浆中1-磷酸鞘氨醇的平均浓度，用以计算实际质控样品的理论浓度；/n(3)标准曲线样品的制备及前处理：包括内标工作液的配制、标准系列溶液的配制、工作曲线样品的前处理，其中，/n内标工作液的配制为取C17-S1P标准品，用含2％HCl的DMSO溶液配制成浓度为250μg/mL的储备液；再用甲醇稀释成为20.0ng/mL的内标工作液；/n标准系列溶液的配制为取1-磷酸鞘氨醇标准品，用含2％HCl的DMSO溶液配制成浓度为250μg/mL的储备液，再用甲醇稀释成为200ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、5000ng/mL、7200ng/mL和8000ng/mL的系列标准曲线工作液；/n工作曲线样品的前处理为向380μL的替代基质中分别加入20.0μL的上述用于标准曲线配制的系列标准曲线工作液，配制成相当于1-磷酸鞘氨醇在替代基质中的浓度为10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、1000ng/mL、150ng/mL、250ng/mL、360ng/mL和400ng/mL的样品，分装出2份，每份50.0μL；每份加入450μL的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取150μL上清液，加入等体积的50％甲醇水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；/n(4)质控样品的制备及前处理：包括标准系列溶液的配制、质控样品的前处理，其中，/n标准系列溶液的配制为取1-磷酸鞘氨醇标准品，用含2％HCl的DMSO溶液配制成浓度为250μg/mL的储备液，再用甲醇稀释成为3980ng/mL的高浓度质控工作液；/n质控样品的前处理为向360μL人空白血浆中加入18.0μL相应浓度的高浓度质控工作液，配制320ng/mL的高浓度质控样品，以混合的人空白血浆样品作为137ng/mL的中浓度质控样品，取一定体积人空白血浆，再用替代基质稀释，配制65.0ng/mL的算数中浓度质控样品、25.0ng/mL的低浓度质控样品与10.0ng/m5L的定量下限质控样品，每个质控样品分装出6份，每份50.0μL，每份加入450μL内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取150μL上清液，加入等体积的50％甲醇水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；/n(5)采用内标法定量，以系列1-磷酸鞘氨醇在替代基质中的浓度为横坐标，1-磷酸鞘氨醇与内标C17-S1P的峰面积比为纵坐标，进行线性回归运算，权重因子为1/x...

【技术特征摘要】
1.一种液质联用测定人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)替代基质的选择：选择5％BSA生理盐水溶液作为替代基质进行人血浆中1-磷酸鞘氨醇的方法学验证试验及样品分析试验；
(2)人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的确定：用步骤(1)中所述的替代基质进行标准曲线样品的配制，然后对人血浆中的本底1-磷酸鞘氨醇的浓度进行测定，确定混合后的人血浆中1-磷酸鞘氨醇的平均浓度，用以计算实际质控样品的理论浓度；
(3)标准曲线样品的制备及前处理：包括内标工作液的配制、标准系列溶液的配制、工作曲线样品的前处理，其中，
内标工作液的配制为取C17-S1P标准品，用含2％HCl的DMSO溶液配制成浓度为250μg/mL的储备液；再用甲醇稀释成为20.0ng/mL的内标工作液；
标准系列溶液的配制为取1-磷酸鞘氨醇标准品，用含2％HCl的DMSO溶液配制成浓度为250μg/mL的储备液，再用甲醇稀释成为200ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、5000ng/mL、7200ng/mL和8000ng/mL的系列标准曲线工作液；
工作曲线样品的前处理为向380μL的替代基质中分别加入20.0μL的上述用于标准曲线配制的系列标准曲线工作液，配制成相当于1-磷酸鞘氨醇在替代基质中的浓度为10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、1000ng/mL、150ng/mL、250ng/mL、360ng/mL和400ng/mL的样品，分装出2份，每份50.0μL；每份加入450μL的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取150μL上清液，加入等体积的50％甲醇水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；
(4)质控样品的制备及前处理：包括标准系列溶液的配制、质控样品的前处理，其中，
标准系列溶液的配制为取1-磷酸鞘氨醇标准品，用含2％HCl的DMSO溶液配制成浓度为250μg/mL的储备液，再用甲醇稀释成为3980ng/mL的高浓度质控工作液；
质控样品的前处理为向360μL人空白血浆中加入18.0μL相应浓度的高浓度质控工作液，配制320ng/mL的高浓度质控样品，以混合的人空白血浆样品作为137ng/mL的中浓度质控样品，取一定体积人空白血浆，再用替代基质稀释，配制65.0ng/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：李健，吴昱，周振东，奚成龙，闻常青，
申请(专利权)人：南京希麦迪医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32