一种液质联用测定人血浆中尼美舒利浓度的方法技术

本发明专利技术目的在于提供一种可以准确测定人血浆中尼美舒利浓度的方法，该方法包括：(1)工作曲线样品的制备；(2)质控样品的制备(3)血浆样品的前处理；(4)LC‑MS/MS分离分析；(5)采用内标法，以系列尼美舒利在基质中的浓度为横坐标，尼美舒利与内标甲苯磺丁脲的峰面积比为纵坐标，通过使用权重因子1/x2，线性回归得到理论浓度与响应之间的线性关系进行定量。本发明专利技术的方法具有专属性强、准确度和灵敏度高的特性。

A method for the determination of nimesulide in human plasma by LC-MS

【技术实现步骤摘要】
一种液质联用测定人血浆中尼美舒利浓度的方法
本专利技术属于医药检测
，特别涉及一种检测人血浆中尼美舒利浓度的方法。
技术介绍
尼美舒利(N-(4-nitro-2-phenoxyphenyl)methanesulfonamide)是一种非甾体类抗炎药，具有抗炎、解热、阵痛等药理作用。尼美舒利是选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂(马锦芳，陈飞鹏，黄文杰等，盐酸头孢他美酯单药或联合头孢曲松序贯治疗下呼吸道感染的临床研究.中国实用内科杂志，2008，28(8):644.)，与其他非甾体抗炎药相比，尼美舒利作用时间较长，生物利用度高，具有良好的耐受性(C.Giachetti,A.Tenconi,Determinationofnimesulideandhydroxynimesulideinhumanplasmabyhighperformanceliquidchromatography,Biomed.Chromatogr.12(1998)50–56.)。适用于类风湿性关节炎和骨关节炎、手术和畸形创伤后的疼痛和炎症、耳鼻咽部炎症引起的疼痛、痛经、上呼吸道感染引起的发热等症状的治疗。目前，人血浆中尼美舒利作为内源性物质，能否准确定量是检测的难点。本专利技术建立了一种科学、快速和准确的液质联用测定人血浆中尼美舒利浓度的方法，可用于尼美舒利相关制剂的生物等效性评价等相关研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以准确定量、简便和快速测定患者血浆样品中尼美舒利浓度的方法。本专利技术的技术方案如下：一种液质联用测定人血浆中尼美舒利浓度的方法，该方法包括：(1)工作曲线样品的制备：包括内标溶液的配制、标准系列溶液的配制、工作曲线样品的前处理，其中，内标溶液的配制为称取适量的甲苯磺丁脲标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于DMSO中，得到储备液,再用乙腈将储备液稀释成为240ng/mL的内标工作液；标准系列溶液的配制为称取适量的尼美舒利标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于DMSO中，得到储备液，再用50％乙腈水溶液稀释成为不同浓度的系列标准曲线工作液；工作曲线样品的前处理为向190μL空白血浆中分别加入10.0μL的本步骤上述系列标准曲线工作液，配制成相当于尼美舒利在血浆基质中的浓度为1.00、2.00、20.0、200、400、1000、1800和2000ng/mL的标准血浆样品，然后每个浓度以50.0μL为单位，分装出2份；每份加入350μL的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μL上清液，加入240μL的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。(2)质控样品的制备：包括质控系列溶液的配制、质控样品的前处理，其中，质控系列溶液的配制为称取适量的尼美舒利标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于DMSO中，得到储备液，再用50％乙腈水溶液稀释成为高浓度质控工作液、中浓度质控工作液、算数中浓度质控工作液、低浓度质控工作液和定量下限质控工作液的系列质控工作液；质控样品的前处理为向380μL空白血浆中分别加入20.0μL的上述系列用于质控样品配制的系列质控工作溶液，配制相当于尼美舒利在血浆基质中的浓度为1600ng/mL的高浓度质控、800ng/mL的中浓度质控、100ng/mL的算数中浓度质控、3.00ng/mL的低浓度质控和1.00ng/mL的定量下限质控的质控血浆样品，然后每个浓度以50.0μL为单位，分装出6份；每份加入350μL的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μL上清液，加入240μL的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。(3)血浆样品的前处理：取受试者的血浆加入内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取上清液，加入20％乙腈水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。(4)采用内标法定量，对人血浆中尼美舒利的浓度进行测定。优选的，所述步骤(1)的标准系列溶液的配制中，用50％乙腈水溶液稀释储备液得到的不同浓度的系列标准曲线工作液，其浓度分别为20.0、40.0、400、4000、8000、20000、36000和40000ng/mL。优选的，所述步骤(2)的质控系列溶液的配制中，高浓度质控工作液浓度为32000ng/mL、中浓度质控工作液浓度为16000ng/mL、算数中浓度质控工作液浓度为2000ng/mL、低浓度质控工作液浓度为60.0ng/mL和定量下限质控工作液浓度为20.0ng/mL。优选的，所述步骤(3)具体为：取受试者的血浆50.0μL，每份加入350μL内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μL上清液，加入240μL的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。优选的，所述步骤(4)中，采用内标法，以系列尼美舒利在血浆基质中的浓度为横坐标，尼美舒利与内标甲苯磺丁脲的峰面积比为纵坐标，进行线性回归运算，权重因子为1/x2，得到线性回归方程，即为工作曲线，对人血浆中尼美舒利的浓度进行测定。优选的，所述LC-MS/MS测定的条件包括：液相色谱条件：色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC181.7μm(50x2.1mm)；流动相：A＝0.1％甲酸水溶液；B＝乙腈溶液，梯度如下：0-0.80min，流动相A为75.0％，流动相B为25.0％；0.80-0.90min，流动相A从75.0％到40％，流动相B从25.0％到60.0％；0.90-2.00min，流动相A保持为40.0％，流动相B保持为60.0％；2.00-2.10min，流动相A从40.0％到10.0％，流动相B从60.0％到90.0％；2.10-2.80min，流动相A保持为10.0％，流动相B保持为90.0％；2.80-3.00min，流动相A从10.0％到75.0％，流动相B从90.0％到25.0％；3.00-3.80min，流动相A保持为75.0％，流动相B保持为25.0％；流速：0.500mL/min；柱温：40℃；进样量：10.0μL。质谱检测器及条件：质谱检测器为ABSciexTripleQuad5500；离子源为电喷雾离子源；喷雾电压为-4500V；离子源温度：450℃；帘气(CUR)：20psi，碰撞气(CAD)：9psi，GS1：40psi，GS2：40psi；负离子方式检测；扫描方式：MRM；尼美舒利定量离子对为307.0→229.1，碰撞电压为-22.0eV；内标甲苯磺丁脲定量离子对为269.1→169.9，碰撞电压为-15.0eV。本专利技术的有益效果：本专利技术利用液质联用测定血浆样品中尼美舒利的浓度，该方法具有快速、专属、准确的特点。本专利技术的方法无需昂贵的设备和试剂，血浆用量少，成本低，适合常规治疗药物检测。附图说明图1为空白替代基质色谱图；图1a为分析物尼美舒利离子通道色谱图；图1b为内标甲苯磺丁脲离子通道色谱图；图2为标准曲线定量下限色谱图；图2a为分析物尼美舒利(1.00ng/mL)在空白血浆中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液质联用测定人血浆中尼美舒利浓度的方法，其特征在于，该方法包括：/n(1)工作曲线样品的制备：包括内标溶液的配制、标准系列溶液的配制、工作曲线样品的前处理，其中，内标溶液的配制为称取适量的甲苯磺丁脲标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于DMSO中，得到储备液,再用乙腈将储备液稀释成为240ng/mL的内标工作液；/n标准系列溶液的配制为称取适量的尼美舒利标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于DMSO中，得到储备液，再用50％乙腈水溶液稀释成为不同浓度的系列标准曲线工作液；/n工作曲线样品的前处理为向190μL空白血浆中分别加入10.0μL的本步骤上述系列标准曲线工作液，配制成相当于尼美舒利在血浆基质中的浓度为1.00、2.00、20.0、200、400、1000、1800和2000ng/mL的标准血浆样品，然后每个浓度以50.0μL为单位，分装出2份；每份加入350μL的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μL上清液，加入240μL的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；/n(2)质控样品的制备：包括质控系列溶液的配制、质控样品的前处理，其中，/n质控系列溶液的配制为称取适量的尼美舒利标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于DMSO中，得到储备液，再用50％乙腈水溶液稀释成为高浓度质控工作液、中浓度质控工作液、算数中浓度质控工作液、低浓度质控工作液和定量下限质控工作液的系列质控工作液；/n质控样品的前处理为向380μL空白血浆中分别加入20.0μL的上述系列用于质控样品配制的系列质控工作溶液，配制相当于尼美舒利在血浆基质中的浓度为1600ng/mL的高浓度质控、800ng/mL的中浓度质控、100ng/mL的算数中浓度质控、3.00ng/mL的低浓度质控和1.00ng/mL的定量下限质控的质控血浆样品，然后每个浓度以50.0μL为单位，分装出6份；每份加入350μL的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μL上清液，加入240μL的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；/n(3)血浆样品的前处理：取受试者的血浆加入内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取上清液，加入20％乙腈水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；/n(4)采用内标法定量，对人血浆中尼美舒利的浓度进行测定。/n...

【技术特征摘要】
1.一种液质联用测定人血浆中尼美舒利浓度的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)工作曲线样品的制备：包括内标溶液的配制、标准系列溶液的配制、工作曲线样品的前处理，其中，内标溶液的配制为称取适量的甲苯磺丁脲标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于DMSO中，得到储备液,再用乙腈将储备液稀释成为240ng/mL的内标工作液；
标准系列溶液的配制为称取适量的尼美舒利标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于DMSO中，得到储备液，再用50％乙腈水溶液稀释成为不同浓度的系列标准曲线工作液；
工作曲线样品的前处理为向190μL空白血浆中分别加入10.0μL的本步骤上述系列标准曲线工作液，配制成相当于尼美舒利在血浆基质中的浓度为1.00、2.00、20.0、200、400、1000、1800和2000ng/mL的标准血浆样品，然后每个浓度以50.0μL为单位，分装出2份；每份加入350μL的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μL上清液，加入240μL的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；
(2)质控样品的制备：包括质控系列溶液的配制、质控样品的前处理，其中，
质控系列溶液的配制为称取适量的尼美舒利标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于DMSO中，得到储备液，再用50％乙腈水溶液稀释成为高浓度质控工作液、中浓度质控工作液、算数中浓度质控工作液、低浓度质控工作液和定量下限质控工作液的系列质控工作液；
质控样品的前处理为向380μL空白血浆中分别加入20.0μL的上述系列用于质控样品配制的系列质控工作溶液，配制相当于尼美舒利在血浆基质中的浓度为1600ng/mL的高浓度质控、800ng/mL的中浓度质控、100ng/mL的算数中浓度质控、3.00ng/mL的低浓度质控和1.00ng/mL的定量下限质控的质控血浆样品，然后每个浓度以50.0μL为单位，分装出6份；每份加入350μL的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取60.0μL上清液，加入240μL的20％乙腈水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；
(3)血浆样品的前处理：取受试者的血浆加入内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取上清液，加入20％乙腈水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；
(4)采用内标法定量，对人血浆中尼美舒利的浓度进行测定。


2.根据权利要求1所述的液质联用测定人血浆中尼美舒利浓度的方法，其特征在于，所述步骤(1)的标准系列溶液的配制中，用50％乙腈水溶液稀释储备液得到的不同浓度的系列标准曲线工作液，其浓度分别为20.0、40.0、400、4000、8000、20000、36000和40000ng/...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴昱，周振东，刘虹霞，蒋媛媛，武晋宇，高峰，
申请(专利权)人：南京希麦迪医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32