一种通过yoaD和yoaE基因共缺失提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过yoaD和yoaE基因共缺失提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法，属于基因工程技术领域。一种yoaD、yoaE表达基因通过负向调控提高重组菌的GlmS酶活力的应用，所述yoaD表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述yoaE表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术首次发现了大肠杆菌染色体上的yoaD与yoaE基因敲除后可以提高菌株表达外源GlmS酶的能力，且它们之间具有叠加增效的技术效果，这对于整个氨糖的合成途径有着重要的意义，并且敲除成功后不会留下任何抗性基因残留；两个基因的共缺失后，使得工程菌株表达外源GlmS的能力较原始菌株提高3倍左右。

A method to improve GLMs activity of Escherichia coli by CO deletion of yoad and yoae genes

【技术实现步骤摘要】
一种通过yoaD和yoaE基因共缺失提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法
本专利技术涉及一种通过yoaD和yoaE基因共缺失提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法，属于基因工程

技术介绍
氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)，俗称氨基糖，简称氨糖，是葡萄糖的一个羟基被一个氨基取代的化合物，是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成分，还是糖蛋白的主要组成部分。GlmS是氨糖生产的关键酶蛋白，因此其酶活的提高将对GlcN的生产有至关重要的作用。中国专利文献CN109929791A(申请号201910301799.0)公开了一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用，属于遗传工程
以大肠杆菌作为宿主表达，通过敲除大肠杆菌中氨基葡萄糖合成途径中的4个基因：乙酰氨基葡萄糖转运子编码基因nagE、甘露糖磷酸转运子编码基因manXYZ、脱乙酰基酶基因nagA和脱氨基酶基因nagB基因，获得重组大肠杆菌，并将重组大肠杆菌应用于氨基葡萄糖的生产中，实现了阻断产物氨基葡萄糖由胞外到胞内的运输途径；并通过过量表达氨基葡萄本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种yoaD表达基因通过负向调控提高重组菌的GlmS酶活力的应用，所述yoaD表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种yoaD表达基因通过负向调控提高重组菌的GlmS酶活力的应用，所述yoaD表达基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种yoaE表达基因通过负向调控提高重组菌的GlmS酶活力的应用，所述yoaE表达基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.如权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组菌为重组大肠杆菌。


4.一种提高重组菌的GlmS酶活力的方法，通过敲除GlmS酶表达菌中的yoaD表达基因和yoaE表达基因制备重组菌实现；所述yoaD表达基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述yoaE表达基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将pKD46质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，构建BL21-pKD46工程菌株；
(2)将yoaD基因上游区的500bp碱基，pKD13质粒中的FRT-kan-FRT结构框和yoaE基因的下游区500bp碱基利用重叠PCR构建成整合片段-1；
(3)将步骤(2)中的整合片段-1转化进入经过诱导的BL21-pKD46感受态细胞；
(4)利用red同源重组技术分别敲除步骤(3)菌株的染色体上的yoaD基因和yoaE基因，制得BL21-△yoaD-△yoaE-pKD46工程菌株(含有FRT-kan-FRT结构框)；
(5)清除步骤(4)构建的BL21-△yoaD-△yoaE-pKD46工程菌株中的pKD46质粒，制得含有FRT-kan-FRT结构框的BL21-△yoaD-△yoaE工程菌株；
(6)将pCP20质粒转化步骤(5)构建的含有FRT-kan-FRT结构框的BL21-△yoaD-△yoaE工程菌株感受态细胞，制得BL21-△yoaD-△yoaE-pCP20工程菌株；
(7)清除步骤(6)构建的BL21-△yoaD-△yoaE-pCP20菌株中的pCP20质粒，得到BL21-△yoaD-△yoaE工程菌株；
(8)构建工程质粒pET-Duet1-glms-gnal，将工程质粒pET-Duet1-glms-gnal转化步骤(7)制得的BL21-△yoaD-△yoaE工程菌株，制得BL21-△yoaD-△yoaE-glms-gnal工程菌株。


6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，BL21-pKD46工程菌株的构建方法如下：
将pKD46质粒通过化学转化法转化进入BL21(DE3)感受态细胞，在抗性平板上筛选阳性克隆子。


7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，敲除同源片段的构建方法如下：
分别在yoaD基因的上游区和yoaE基因的下游区选取500bp作为同源臂，随后通过重叠PCR将pKD13质粒中的FRT-kan-FRT结构框连接到两个同源臂之间，即构建得到整合片段-1。


8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)与步骤(4)中，利用red同源重组基因编辑技术敲除的具体步骤如下：
(i)将BL21-pKD46工程菌株在含有浓度100μg/mL氨苄抗生素平板上划线，30℃过夜；
(ii)选取阳性克隆子在含有浓度100μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中培养，当OD600＝0.2时，添加L-阿拉伯糖至终浓度为10mM进行诱导培养；当OD600＝0.6时停止诱导并利用氯化钙法制做BL21-pKD46感受态；
(iii)将步骤(2)中构建的敲除同源片段通过化学转化法转化进入BL21-pKD46感受态，并在含有浓度100μg/mL氨苄抗生素与浓度50μg/mL卡纳抗生素平板上涂板过夜；
(iv)从过夜的平板上挑取单...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丕武，李康，汪俊卿，王瑞明，李旭，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37