一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于禽沙门菌病的防治领域，具体涉及一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株及其制备方法和应用。通过同源重组技术无痕敲除rfbE基因，无任何外源的碱基残留，构建DIVA减毒沙门菌疫苗，通过动物试验发现，所述DIVA减毒沙门菌疫苗，不仅可以运用PAT方法区分疫苗免疫动物和野生菌感染动物，而且可以对强毒力鸡白痢沙门菌提供良好的保护作用，有效清除强毒力菌株感染。接种本发明专利技术鸡白痢沙门菌减毒活疫苗后，所述疫苗具有良好的免疫原性，对雏鸡可提供坚实的免疫保护效果。疫苗株毒力显著降低，在宿主体内定殖时间明显缩短，接种后鸡只无不良反应，通过玻板凝集试验即可快速地区分疫苗接种鸡与自然感染鸡。

A single gene knockout attenuated strain of Salmonella pullorum and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株及其制备方法和应用
本专利技术属于禽沙门菌病的防治领域，具体涉及一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株及其制备方法和应用。
技术介绍
沙门菌是一种重要的病原菌，能够感染人和动物，严重威胁人和动物健康，是研究较为广泛和深入的细菌之一。鸡白痢沙门菌是沙门菌属中的一种沙门菌，该沙门菌主要感染禽类，是一种宿主专嗜性病原菌，主要侵害20日龄以内的雏鸡，雏鸡感染后表现出典型的白色下痢症状，呈高发病率和高死亡率。成年鸡感染呈现隐形带菌，长期携带和间歇排菌，无明显临床症状。该沙门菌既可水平传播，造成群体感染，又可通过卵巢垂直经蛋传播给子代，使得该菌能够在养鸡场反复存在，难以清除。因此，鸡白痢沙门菌对养鸡场造成的严重危害，引起巨大的经济损失。该沙门菌在全世界都受重视，在发达国家已经通过措施被净化，但是最近在发达国家又有多起鸡白痢沙门菌病再次发生的报道。而在发展中国家仍然是关注的主要疾病，还没有被净化。国内常采用抗生素药物控制法，造成了细菌耐药性和药物残留等一系列问题，导致超级耐药细菌的出现，严重威胁人类的健康，因此WHO呼吁各国政府限制抗生素的使用。我国政府响应WHO呼吁，在我国境内执行限制使用抗生素的“限抗令”。疫苗使用也是预防该沙门菌的措施之一，许多国家逐渐转向使用疫苗预防来控制沙门菌，取得了很好的效果。近年来，利用基因工程技术将强毒株毒力相关基因敲除构建的新型减毒沙门菌用作疫苗的研究备受关注，新型减毒活疫苗安全性好、不易返祖；在减毒的同时不丧失免疫原性，并且可在免疫期内于免疫动物体内繁殖，能刺激机体产生全面的系统免疫反应和局部免疫反应，可对病原体的多种抗原产生免疫应答；免疫力坚实，免疫期长，比灭活疫苗和亚单位疫苗在预防控制鸡沙门菌的感染方面更有优势，因而是较为理想的疫苗。在养鸡场，对该沙门菌的检测普遍使用玻板凝集试验(PAT)进行检测，该方法简单方便快捷廉价等优点，但该方法无法区分血清中的抗体是常规疫苗免疫所致还是野生菌感染所致，因此需要一种DIVA(DifferentiationofInfectedandVaccinatedAnimals)疫苗，配合PAT检测，从而实现养鸡场鸡白痢沙门菌的净化。
技术实现思路
鉴于以上现有技术的情况，本专利技术的目的在于提供一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株及其制备方法和应用。所述减毒株在宿主体内定殖时间明显缩短，接种后鸡只无不良反应，对强毒力鸡白痢沙门菌提供良好的保护作用，可有效清除强毒力菌株感染。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株，所述减毒株为rfbE基因不表达的鸡白痢沙门菌。进一步的，所述减毒株为采用自杀质粒同源重组的方法将rfbE基因无痕敲除的鸡白痢沙门菌。进一步的，所述rfbE基因序列如SEQIDNO：2所示。进一步地，所述减毒株还可经过其他基因改造。所述的其他基因改造是指除rfbE基因敲除以外的基因改造。所述其他基因改造可以是单个目标基因的改造或者为多个感兴趣目标基因的改造。感兴趣目标基因并不特指，可以根据研究需要设定并改造。例如，可以是一个、两个、三个以上目标基因的改造。理论上可以不断对其进行基因改造，对于目标基因的改造数量可以按照需要操作，没有特别限制。基因改造具体是指通过生物或化学或物理的手段使基因相比改造前在结构上发生变化。这种变化主要是指碱基对组成的变化，包括但不限于一个或多个碱基对的替换、增添、缺失引起的改变。所述基因改造包括但不限于目标基因的敲入、目标基因的敲除等。目标基因的敲入、目标基因的敲除可以采用基因打靶、同源重组等技术来完成。本专利技术的第二方面，提供一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株构建方法，包括以下步骤：将野生型鸡白痢沙门菌中的rfbE基因无痕敲除。进一步的，所述基因敲除方法为采用同源重组的无痕敲除方法。进一步的，包括以下步骤：野生型鸡白痢沙门菌的rfbE基因上下游同源片段扩增与纯化；将pGMB152质粒与野生型鸡白痢沙门菌的rfbE基因上下游同源片段连接；将rfbE基因重组片段电转入χ7213感受态中并筛选阳性重组菌；将筛选得到的阳性重组菌与野生型鸡白痢沙门菌接合转移，并筛选阳性重组菌，得到鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株。可以采用现有的基因编辑方法敲除所述rfbE基因。优选地，可采用同源重组的方法敲除rfbE基因。在优选的实施例中，采用自杀质粒同源重组的方法敲除rfbE基因。还可采用其他方法实现基因敲除，并不限于实施例所列举的方式。基于rfbE基因的敲除，rfbE基因的完整序列或部分序列从染色体DNA中去除。本专利技术的第三方面，提供所述鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株在制备沙门菌活疫苗中的用途。进一步的，所述沙门菌为鸡白痢沙门菌。本专利技术的第四方面，提供所述鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株在制备沙门菌感染治疗药物中的用途。本专利技术提供了rfbE基因作为靶基因在筛选鸡白痢沙门菌感染治疗药物中的用途。本专利技术所述鸡白痢沙门菌感染治疗药物为以rfbE基因为治疗靶基因，使rfbE基因敲除、不表达的药物或者以rfbE基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以rfbE基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以rfbE基因为靶点，筛选使这两个基因不表达的药物，用于使鸡白痢沙门菌毒性减弱，以治疗鸡白痢沙门菌感染。例如，该鸡白痢沙门菌感染治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使rfbE基因敲除或不表达；或者通过制备rfbE蛋白拮抗剂，使rfbE基因表达的蛋白不发挥作用。本专利技术的第五方面，提供一种鸡白痢沙门菌活疫苗，所述疫苗含有如权利要求1～3任一权利要求所述的鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株。进一步的，所述鸡白痢沙门菌活疫苗中还含有佐剂。鸡白痢沙门菌为现有技术，具体信息为：Accession:NC_021984.1；GI:529218781。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术旨研制了一种单基因无痕敲除的鸡白痢沙门菌减毒株，本专利技术通过动物试验发现，所述突变株毒力显著降低，在宿主体内定殖时间明显缩短，接种后鸡只无不良反应，对强毒力鸡白痢沙门菌提供良好的保护作用，可有效清除强毒力菌株感染。进一步的，采用所述减毒株做制备的鸡白痢沙门菌活疫苗，其毒力相对于野生型鸡白痢沙门菌显著降低，表现在其对3日龄海兰白雏鸡的致死剂量明显提高。接种本专利技术鸡白痢沙门菌减毒活疫苗后，宿主不产生针对O-抗原的抗体，通过鸡白痢鸡伤寒多价检测抗原，可有效的应用玻板凝集试验对免疫接种鸡和自然感染鸡予以区分。所述疫苗具有良好的免疫原性，对雏鸡可提供坚实的免疫保护效果，并且可以通过玻板凝集试验快速地区分疫苗接种鸡与自然感染鸡。亦即，所述疫苗具有区分免疫接种鸡和自然感染鸡的功能，通过玻板凝集试验即可加以区别，疫苗应用不影响鸡白痢阳性鸡检疫淘汰制度的实施。附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株，其特征在于，所述减毒株为rfbE基因不表达的鸡白痢沙门菌，无任何外源碱基残留。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株，其特征在于，所述减毒株为rfbE基因不表达的鸡白痢沙门菌，无任何外源碱基残留。


2.根据权利要求1所述的鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株，其特征在于，所述减毒株为采用自杀质粒同源重组的方法将rfbE基因无痕敲除的鸡白痢沙门菌。


3.据权利要求2所述的鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株，其特征在于，所述rfbE基因序列如SEQIDNO：2所示。


4.一种鸡白痢沙门菌单基因无痕敲除减毒株构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将野生型鸡白痢沙门菌中的rfbE基因无痕敲除。


5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述基因敲除方法为采用同源重组的无痕敲除方法。


6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
野生型鸡白痢...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，蔡媛，耿士忠，刘桂凤，张健，潘志明，顾丹，孙林，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32