利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法技术方案

本发明专利技术提供一种利用昆虫细胞‑杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法。利用本方法可进行悬浮细胞摇瓶培养及发酵罐生产。对基于Sf9细胞悬浮培养技术的重组蛋白表达效果进行检测，目的蛋白可达到分泌型表达，无需细胞冻融及其复杂的纯化工艺。本工艺简单，易放大，无需换液，仅使用一种培养基便能够达到细胞生长繁殖及蛋白表达的目的。

Efficient expression of recombinant protein by insect cell baculovirus expression system

【技术实现步骤摘要】
利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法。
技术介绍
昆虫细胞-杆状病毒表达系统是一种利用离体昆虫细胞可持续培养，利用接种杆状病毒表达载体进行目的蛋白表达的体系。可持续性的昆虫细胞系最早在1962年由Grace建立，经过多年的发展与扩充，目前从来自100多种昆虫建立了500多株细胞系。这些细胞系主要来源于双翅目和鳞翅目的农业害虫，其来源组织包括卵巢、精巢、胚胎、成虫盘、血细胞、中肠、脂肪体等，其中用卵巢组织和胚胎组织建立的细胞系最多。迄今，虽然已建立的昆虫细胞系众多，但使用最为成熟的是粉纹夜蛾(Trichoplusiani)胚胎细胞系HighFive、草地贪叶蛾(SpodopteraFrugiperda)卵巢细胞系Sf21及其克隆株Sf9。相比其他表达系统，昆虫表达系统具有表达效率高、生产成本较低、操作简便、蛋白能够进行后加工等。对于昆虫细胞培养及其表达系统的进一步优化，能够有效地推广表达系统的市场价值，进一步提高外源蛋白的综合表达效率，对生物医药的发展具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法，特别是一种基于SF9细胞无血清悬浮培养技术的重组蛋白表达工艺。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法，包括以下步骤：(1)通过Bac-to-Bac系统，构建包含编码重组蛋白DNA片段的重组穿梭质粒Bacmid，然后将重组穿梭质粒Bacmid与转染试剂混匀后转染悬浮培养的昆虫细胞，当细胞活率降至60-80％时收获培养上清(病毒液)，即为P0代重组杆状病毒；(2)用P0代重组杆状病毒接种摇瓶中悬浮培养的昆虫细胞，在转数130-150rpm，温度27±0.5℃条件下进行摇床培养，当≥90％的细胞发生明显病变并失去活力时，收获培养上清；接种时，细胞密度为2×106-4×106个/mL，装液量为摇瓶体积的1/4～1/3。所述方法还包括在步骤(2)之后逐级扩大培养感染细胞的步骤，按照1：8-1：10的比例扩大培养细胞，当≥90％的细胞发生明显病变并失去活力时，收获培养上清。细胞培养条件如下：发酵罐的装液量为3/5～4/5，发酵罐搅拌转数130～150rpm，DO值控制为40±10％，温度控制为27±0.5℃，pH控制为6.2±0.2进行发酵罐培养。步骤(2)中接种病毒的比例为0.1％～1％v/v，即按照0.1％～1％v/v的比例将病毒液接种至细胞培养液中。本专利技术中，所述昆虫细胞为Sf9或Sf21。用于培养Sf9细胞的培养液购自上海源培生物科技股份有限公司，InsectProSF9/SF21昆虫细胞无血清培养基，货号H810KJ。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：(一)工艺简单，条件参数易于控制，且细胞培养极易放大。接种病毒后的细胞培养期间，无需换液即可达到细胞培养、病毒传代、目的蛋白表达的效果。(二)经过正确构建的杆状病毒表达载体，所表达的目的蛋白呈现可溶性分泌型表达，无需冻融破碎细胞，无需复杂的后期纯化工艺。为工业化大生产提供可能性。(三)利用本工艺表达的蛋白具有较高活力，所表达的抗原蛋白具有良好的攻毒保护效果。附图说明图1为本专利技术实施例1中健康Sf9细胞(左)与病变细胞(右)对比。图2为本专利技术实施例1中抗原琼扩效价检测结果。图3为本专利技术实施例1中电子显微镜下观察到的病毒样颗粒。图4为本专利技术实施例1中不同时间重组蛋白的表达水平。具体实施方式本专利技术提供一种Sf9细胞无血清悬浮培养及重组蛋白表达工艺，所述方法按照如下步骤进行：1、摇瓶Sf9细胞悬浮培养及重组蛋白小量表达(1)Sf9悬浮细胞的复苏：取液氮中冻存的Sf9细胞，在27℃温水中迅速融化后，1000rpm离心10min，收集沉淀，去除上清。使用昆虫细胞培养基将细胞稀释至1×106细胞/mL，置于摇床中，27℃，140rpm培养24h。(2)Sf9细胞的培养：取培养24h的细胞液，测定细胞活力，于1000rpm离心10min，收集沉淀。细胞沉淀等体积重悬，继续培养至细胞数达到5×106细胞/mL。测定细胞活力，若活力≥90％，即可进行重组杆状病毒接种工作。(3)重组杆状病毒接种：取数量达到5×106细胞/mL且活力≥90％的Sf9细胞培养液，使用新鲜预热的Sf9昆虫细胞培养基，将细胞稀释至2×106细胞/mL，并按照当前体积的0.1％v/v接种重组杆状病毒。(4)接种后的观察及病变判断：将接毒后的Sf9细胞培养液置于27℃，140rpm培养，每12h观察细胞病变状态并对其进行计数。一般在接种后72h可明显看到Sf9细胞出现病变。其病变状态为：细胞活力降低，病变细胞体积明显大于健康细胞。(5)传代用重组杆状病毒的制备：收取72h发生病变的SF9细胞培养液，离心取上清，并按照表达蛋白的种类测定其琼扩效价、SDS-PAGE、WesternBlot等，同时对检测出有效蛋白的培养样品进行保存，作为Fx代病毒储存，传代不超过10代。(6)重组蛋白的表达：将表达用代次重组病毒接种Sf9细胞，接种168-192h后检测细胞活力。当≥90％的SF9细胞发生明显病变并失去活力时，收取培养液。1000rpm离心10min，取上清，根据其表达蛋白的种类测定其琼扩效价、SDS-PAGE、WesternBlot等。2、细胞放大及发酵罐培养(1)细胞放大：取培养至5×106细胞/mL且活力≥90％的SF9细胞培养液，使用新鲜预热的Sf9细胞培养基，稀释至细胞浓度为0.5×106-0.8×106细胞/mL并转移入下一级培养设备，若所需放大次数较多，则可以重复上述操作，直至将培养液放大进入大容量生物反应器内。(2)细胞的培养：在反应器内，Sf9细胞的培养参数为：搅拌转数150rpm，DO值40±10％，温度控制27±0.5℃，pH控制6.2±0.1，进行发酵罐培养。(3)病毒接种：当反应器内Sf9细胞达到5×106细胞/mL时，在反应器内通入新鲜的Sf9细胞培养基，将其稀释至2×106细胞/mL后，按照0.1％的比例加入表达用重组杆状病毒。(4)中试目的蛋白表达液的收获：将接种了病毒保存液后的Sf9细胞，保持参数继续培养，期间每24h取样进行计数、细胞活力检测等，培养至168-192h时，≥90％的细胞发生病变并丧失活力，此时培养液中可溶性目的蛋白表达量达到最高。收获培养液，离心去除细胞碎片，将上清长期保存，并通过SDS-PAGE检测其表达效果。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&Russe本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)通过Bac-to-Bac系统，构建包含编码重组蛋白DNA片段的重组穿梭质粒Bacmid，然后将重组穿梭质粒Bacmid与转染试剂混匀后转染悬浮培养的昆虫细胞，当细胞活率降至60-80％时收获培养上清，即为P0代重组杆状病毒；/n(2)用P0代重组杆状病毒接种摇瓶中悬浮培养的昆虫细胞，在转数130-150rpm，温度27±0.5℃条件下进行摇床培养，当≥90％的细胞发生明显病变并失去活力时，收获培养上清；接种时，细胞密度为2×10

【技术特征摘要】
1.利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过Bac-to-Bac系统，构建包含编码重组蛋白DNA片段的重组穿梭质粒Bacmid，然后将重组穿梭质粒Bacmid与转染试剂混匀后转染悬浮培养的昆虫细胞，当细胞活率降至60-80％时收获培养上清，即为P0代重组杆状病毒；
(2)用P0代重组杆状病毒接种摇瓶中悬浮培养的昆虫细胞，在转数130-150rpm，温度27±0.5℃条件下进行摇床培养，当≥90％的细胞发生明显病变并失去活力时，收获培养上清；接种时，细胞密度为2×106-4×106个/mL，装液量为摇瓶体积的1/4～1/3。

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【专利技术属性】
技术研发人员：袁野，岳建新，王飞，孙灵睿，周蕾蕾，陈秋阁，向王震，张秀美，李浩鹏，李浩哲，朱昊敏，魏杰，安铁军，
申请(专利权)人：乾元浩生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11