一种评估CART细胞输注后免疫毒性检测方法技术

本发明专利技术提供了一种评估CD19CART细胞免疫毒性的方法。主要通过体内实验来检测CD19CART对机体是否产生非肿瘤组织的靶向毒性、肿瘤组织的脱靶毒性、细胞因子释放综合征。系统的阐述了CART细胞进入临床前的免疫毒性。

A method for evaluating immunotoxicity of cart cells after infusion

【技术实现步骤摘要】
一种评估CART细胞输注后免疫毒性检测方法
本专利技术涉及医药生物领域，具体涉及一种CART细胞免疫毒性的检测方法。
技术介绍
嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。已有的临床研究结果和CAR-T治疗的原理显示CAR-T细胞产品必然具有免疫毒性，目前研究结果也显示免疫毒性，如CRS等，与细胞治疗的效果显著相关。然而，因非临床研究中尚无可以直接预测人CAR-T细胞的临床免疫毒性风险的理想的动物模型，因此需要对不同动物模型中获得的免疫毒性检测结果进行客观的分析，以评价其预测能力。CAR-T细胞在非临床免疫毒性检测指标大致包括：采用流式细胞方法、Luminex、MSD电化学发光检测等方法检测血清细胞因子水平(如IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、INF-γ、TNF-α等)，以期待反映CAR-T细胞的CRS风险；根据使用动物模型的不同，检测动物外周血中淋巴细胞计数及表型分析(如CD3+、CD4+、CD8+等)；异种细胞移植物抗宿主反应(Graft-versus-HostReaction，GvHR)的观察和与临床研究可能相关性的科学评价；免疫器官检查(重量、大体和组织病理检查)。免疫毒性的检测时间点需要根据CAR-T作用机制和不同的动物模型以及预试验结果进行合理的设计。本专利技术阐述了评估CD19-CART细胞输注体内免疫毒性的方法。
技术实现思路
本专利技术的一个方面提供一种评估CD19-CART免疫毒性的方法包括体内实验评估方法。本专利技术的第二方面提供了体内实验评估方法，包括：(Ⅰ)非肿瘤组织的靶向毒性检测；(Ⅱ)细胞因子释放综合征检测。优选的是，非肿瘤组织的靶向毒性检测在抗鼠CD19T细胞注射液重复给药毒性试验中，两次给药后，观察正常C57小鼠的外周血B细胞比例。优选的是，细胞因子释放综合征检测即在抗鼠CD19T细胞注射液重复给药毒性试验中，在不同时间点处死小鼠分离外周血检测细胞因子的释放情况。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术全面的评估CD19-CART细胞输注体内免疫毒性的方法。附图说明图1重复给药模型图具体实施方式实施例本专利技术通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本专利技术决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例里介绍体内评估实验。实施例1.非肿瘤组织的靶向毒性检测1.C57BL小鼠，雌雄各半，6周龄。分为溶媒细胞对照组1、溶媒细胞对照组2、CAR-T组1、CAR-T组2、CAR-T组2，每组50只小鼠。2.尾静脉注射相应溶剂或CAR-T注射液，每只小鼠给药体积200μl。第1、2组给予生理盐水作为溶媒对照；第3、4组给予抗鼠CD19T细胞首次给药1×107个细胞/只；二次给药5×106个细胞/只，第5组给予抗鼠CD19T细胞两次给药均为1×106个细胞/只。第2、3、4组两次给药前1天均进行预处理，预处理方法为腹腔注射环磷酰胺200mg/kg。4.分离鼠源CAR-T重复给药试验各处死组外周血B细胞。本实施例结果显示正常C57小鼠的外周血B细胞比例约40～50％，环磷酰胺预处理组小鼠外周血B细胞比例低于未预处理组。一次给药后，CAR-T细胞靶向CD19+细胞，使得B细胞比例下降。二次给药后，B细胞比例进一步下降，其余趋势与一次给药后相同。实施例2.细胞因子释放综合征检测1.C57BL小鼠，雌雄各半，6周龄。分为溶媒细胞对照组1、溶媒细胞对照组2、CAR-T组1、CAR-T组2、CAR-T组2，每组50只小鼠。2.尾静脉注射相应溶剂或CAR-T注射液，每只小鼠给药体积200μl。第1、2组给予生理盐水作为溶媒对照；第3、4组给予抗鼠CD19T细胞首次给药1×107个细胞/只；二次给药5×106个细胞/只，第5组给予抗鼠CD19T细胞两次给药均为1×106个细胞/只。第2、3、4组两次给药前1天均进行预处理，预处理方法为腹腔注射环磷酰胺200mg/kg。3.在不同时间点处死小鼠分离外周血检测细胞因子的释放情况，检测的细胞因子包括IFNγ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL17a、TNF。本实施例结果显示在对各组不同时间点的细胞因子检测中，未预处理而回输CAR-T细胞组，IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10五个指标均显著升高，显著高于其余组别。而IL17a和TNF两个指标检测到的浓度值始终都比较低，两个指标各个时间点的各组样本结果平均值均小于10pg/ml。说明在未进行环磷酰胺预处理的前提下注射高剂量的CAR-T会引起小鼠的部分细胞因子的增高(IFNγ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10等)，但进行预处理之后，再注射CAR-T(无论剂量高低)均不会引起小鼠细胞因子的增高，与生理盐水对照组无差异。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种评估CD19-CART细胞免疫毒性的方法包括体内实验评估。/n

【技术特征摘要】
1.一种评估CD19-CART细胞免疫毒性的方法包括体内实验评估。


2.权利要求1所述体内实验评估包括非肿瘤组织的靶向毒性检测、细胞因子释放综合征检测。


3.权利要求2所述非肿瘤组织的靶向毒性检测在抗鼠CD19T细胞注射液重复给药毒性试验中，两次给药后，观察正常C57小鼠...

【专利技术属性】
技术研发人员：史子啸，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31