一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法技术

本发明专利技术公开了一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，该方法利用体外重组的三维正常人皮肤模型，采用SDS或机械方法对皮肤造成损伤，通过分析损伤后的恢复情况或炎症反应的强弱，评价受试物质对损伤后皮肤的修复作用，具体包括以下步骤：(1)损伤模型的制备；(2)修复；(3)评价指标的测量；(4)结果分析。该方法具有通量高、可重复、与人相关性高、多指标评价等优点，可以对多种受试物进行快速评价。

An in vitro method for evaluation of repair function by reconstructing three-dimensional skin model of normal human body

【技术实现步骤摘要】
一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法
本专利技术属于修复功能评价
，具体涉及一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法。
技术介绍
皮肤覆盖于人体表面，是人体与感知和接触外界环境的最外屏障。皮肤在受到损伤后，早期出现炎症反应，表现为红肿、渗液、形成结痂。随后角质细胞和成纤维细胞开始增生，肌成纤维细胞分化和伤口收缩，接着细胞和细胞外基质结构重塑，并可能形成肉芽组织或瘢痕。皮肤受损后，外界环境中的理化生物因素直接接触人体组织，容易造成感染、慢性炎症、溃疡等。损伤后的皮肤虽然具有一定的自我修复功能，但是受到损伤面积和严重程度的影响，同时也受到自身修复能力和环境因素的影响。皮肤受损后，通过人为干预，如添加辅料、药物生长因子等，可减少创面水份蒸发、保温、抗菌、消炎和促进细胞增殖等功能不仅起到促进皮肤修复的目的，也可以减少疤痕和色素不均匀等起到美化皮肤的效果。目前广泛用于评价修复功能的模型大都采用实验动物进行，常用的有小鼠、大鼠、豚鼠、小型猪和兔子，制备急性、慢性和瘢痕性损伤模型。但是动物实验周期长、重现性差、且实验过程容易造成动物痛苦。而细胞模型广泛应用于药物筛查阶段，通过人为制造“伤口”，分析细胞增殖、标志物表达、炎性反应等指标，可以实现高通量快速筛查。但是与正常人体皮肤的三维构造仍具有一定的距离，细胞水平的测试缺乏空间结构，功能单一。体外重组三维皮肤模型的出现，填补了从细胞到动物间的差距。采用人源细胞，通过培养形成具有与正常皮肤相类似的三维结构和功能的皮肤模型，可形成稳定的屏障功能，并能表达多种人体皮肤特征蛋白和细胞外基质，还可根据需要构建不同类型的皮肤模型，如表皮模型、全层皮肤模型、含黑色素的皮肤模型等。目前3D皮肤模型已成为替代传统动物皮肤试验的理想替代实验系统。目前，以体外技术为核心的试验方法，逐渐被许多国家和地区的监管部门所接收和认可。全球范围内多个地区和国家通过法规禁止或限制动物试验的进行。但是目前的国际标准只针对样品安全性评估，并没有提出功能或功效的评价方法或标准。采用体外构建的三维皮肤组织进行皮肤修复功能评价，提出了一种新的试验系统，基于细胞培养形成的三维结构，一方面减少了单层细胞水平试验的局限性，如溶解性、体系单一长等，另一方面提供了一种与正常人皮肤结构和功能相似的暴露方式。同时避免了使用过量的实验动物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，该方法具有通量高、可重复、与人相关性高、多指标评价等优点，可以对多种受试物进行快速评价。本专利技术中采用重组正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，是利用体外重组正常人体的三维皮肤模型，采用SDS或机械方法对皮肤造成化学或机械损伤，通过分析损伤后组织的恢复情况或炎症反应的强弱，评价受试物质对损伤后皮肤的修复作用。本专利技术的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，包括以下步骤：(1)损伤模型的制备：选取重建正常人体三维皮肤模型，采用十二烷基磺酸钠或机械损伤方法进行造模，制备损伤模型，同时设置对照组；(2)修复：分别采用无血清培养基或生理盐水、阳性物和受试物对步骤(1)中的损伤模型进行修复，形成损伤组、阳性组和受试物组；(3)评价指标的测量：测量各实验组的电阻、常规组织学或免疫组织学观察、细胞因子水平、蛋白表达水平和相关基因分析各评价指标中的一种或几种；(4)结果分析：各评价指标采用单因素方差分析进行统计学分析，α＝0.05，其中两种以上的评价指标升高或降低有统计学差异时，并且两次独立测试获得一致结果时，认为该受试物在分析条件下具有修复功能。在上述采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法中：优选的，步骤(1)中的重建正常人体三维皮肤模型为商品化来源或实验室按照常规方法自制，其所用种子细胞需来源于人，经特殊培养条件形成具有与正常人体皮肤相类似结构和功能的重组皮肤模型，所选模型需满足特定的质控指标，确保其具有特定的结构和功能。优选的，步骤(1)中损伤模型的制备中的给药方式为将十二烷基磺酸钠直接涂抹在人源三维重组皮肤模型表面，或采用机械损伤方式对重建正常人体三维皮肤模型表面擦伤、刺伤或划伤制备损伤模型。具体是采用微针、砂布或胶带剥离的方法将重建正常人体三维皮肤模型表面擦伤、刺伤或划伤。优选的，步骤(1)中采用十二烷基磺酸钠进行造模，制备损伤模型时，十二烷基磺酸钠的质量百分含量为0.1％-10％，暴露时间为5-60min，温度条件为20-25℃，相对湿度为40％-70％。优选的，步骤(1)中所述的对照组为无血清培养基或生理盐水。进一步的，步骤(1)中所述的对照组还包括受试物对照组，所述受试物对照组也为无血清培养基或生理盐水。优选的，步骤(2)中修复时的给药方式为将无血清培养基或生理盐水、阳性物或受试物直接涂抹在损伤模型表面，或采用培养液给药方式，具体是将损伤模型置于含有无血清培养基或生理盐水、阳性物或受试物培养液中进行给药。优选的，直接涂抹时，受试物浓度为10-50mg/μL，涂抹时间为10-60min，涂抹结束后清洗去除受试物，保持重组皮肤模型表面干燥，所述受试物能进行多次涂抹，涂抹时间间隔为6-24h；采用培养液给药时，所述受试物的质量体积浓度不超过100mg/mL，或所述受试物的质量百分含量不超过10％。优选的，步骤(2)中所述的阳性物为对皮肤具有明显促进修复的物质，所述的受试物为植物提取物、动物提取物、中药提取物、化妆品、化妆品原料或化学品。作为本专利技术的几种优选的实施方式，所述的阳性物为表皮生长因子(EGF)、胎牛血清、细胞外基质、消炎物质或类固醇激素等，所述的受试物为基底膜提取物、壳聚糖、维生素E、海藻糖、脱细胞基质、小分子肽、蛋白多糖和化学制剂等天然或合成的化合物或混合物中的一种或几种。优选的，步骤(2)中采用无血清培养基或生理盐水对步骤(1)中的对照组进行修复；步骤(2)中采用受试物对步骤(1)中的受试物对照组进行修复。优选的，步骤(3)中采用经皮肤电阻仪检测皮肤表面电阻值，采用MTT法或XTT检测组织活性，采用固定组织进行组织学观察分析，采用ELISA方法进行细胞因子水平分析，采用westernblot法进行蛋白表达水平分析，采用PCR法进行相关基因分析。具体的，采用MTT法或XTT测量组织活性，包括以下步骤：将模型置于1mg/mL的MTT或XTT溶液中孵育3-4h，取下模型浸泡于异丙醇中提取甲瓒，在570nm波长下测定吸光度。优选的，步骤(3)中可以将固定组织进行常规组织学或免疫组织学分析、用ELISA方法进行细胞因子水平分析、PCR技术进行基因分析或westernblot进行蛋白分析中的一种或几种联合使用，其中细胞因子水平分析适用于连续监测，即在相同的时间间隔采样后进行测量。具体的，常规组织学分析是采用4％多聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是包括以下步骤：/n(1)损伤模型的制备：选取重建正常人体三维皮肤模型，采用十二烷基磺酸钠或机械损伤方法进行造模，制备损伤模型，同时设置对照组；/n(2)修复：分别采用无血清培养基或生理盐水、阳性物和受试物对步骤(1)中的损伤模型进行修复，形成损伤组、阳性组和受试物组；/n(3)评价指标的测量：测量各实验组的电阻、常规组织学或免疫组织学观察、细胞因子水平、蛋白表达水平和相关基因分析各评价指标中的一种或几种；/n(4)结果分析：各评价指标采用单因素方差分析进行统计学分析，α＝0.05，其中两种以上的评价指标升高或降低有统计学差异时，并且两次独立测试获得一致结果时，认为该受试物在分析条件下具有修复功能。/n

【技术特征摘要】
1.一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是包括以下步骤：
(1)损伤模型的制备：选取重建正常人体三维皮肤模型，采用十二烷基磺酸钠或机械损伤方法进行造模，制备损伤模型，同时设置对照组；
(2)修复：分别采用无血清培养基或生理盐水、阳性物和受试物对步骤(1)中的损伤模型进行修复，形成损伤组、阳性组和受试物组；
(3)评价指标的测量：测量各实验组的电阻、常规组织学或免疫组织学观察、细胞因子水平、蛋白表达水平和相关基因分析各评价指标中的一种或几种；
(4)结果分析：各评价指标采用单因素方差分析进行统计学分析，α＝0.05，其中两种以上的评价指标升高或降低有统计学差异时，并且两次独立测试获得一致结果时，认为该受试物在分析条件下具有修复功能。


2.根据权利要求1所述的采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：步骤(1)中损伤模型的制备中的给药方式为将十二烷基磺酸钠直接涂抹在体外重建正常人体三维皮肤模型表面制备损伤模型，或采用机械损伤方式对重建正常人体三维皮肤模型表面擦伤、刺伤或划伤制备损伤模型。


3.根据权利要求1所述的采用采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：步骤(1)中采用十二烷基磺酸钠进行造模，制备损伤模型时，十二烷基磺酸钠的质量百分含量为0.1％-10％，暴露时间为5-60min，温度条件为20-25℃，相对湿度为40％-70％。


4.根据权利要求1所述的采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：步骤(1)中所述对照组为无血清培养基或生理盐水，步骤(1)中所述的对照组还包括受试物对照组，所述受试物对照组也为无血清培养基或生理盐水。


5.根据权利要求1所述的采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：步骤(2)中修复时的给药方式为将无血清培养基或生理盐水、阳性物或受试物直接涂抹在损伤模型表面，或采用培养液给药方式，具体是将损伤模型置于含有无血清培养基或生理盐水、阳性物或受试物培养液中进行给药。


6.根据权利要求5所述的采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：直接涂抹时，受试物浓度为10-50mg/μL，涂抹时间为10-60min，涂抹结束后清洗去除受试物，保持重组皮肤模型表面干燥，所述受试物能进行多次涂抹，涂抹时间间隔为6-24h；采用培养液给药时，所述受试物的质量体积浓度不超过100mg/mL，或所述受试物的质...

【专利技术属性】
技术研发人员：程树军，黄健聪，冯鉴鸿，
申请(专利权)人：广州市华代生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44