【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改良刺糖多孢菌的高通量(HTP)基因组工程改造平台相关申请的交叉参考本申请要求2017年6月6日提交的美国临时专利申请序列号62/515,934的优先权，其以全文引用的方式并入本文中。关于序列表的陈述以文本格式代替纸本拷贝提供与本申请相关的序列表，并且在此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是ZYMR_013_01WO_SeqList_ST25.txt。文本文件约185KB，创建于2018年6月6日，并且以电子方式通过EFS-Web提交。
本公开涉及高通量(HTP)微生物基因组工程。所公开的HTP基因组工程改造平台由计算机驱动并整合了分子生物学、自动化和先进机器学习方案。这一集成平台利用了一套HTP分子工具集创建HTP基因设计文库，所述基因设计文库尤其利用科学见解和迭代模式识别得到。确切地说，所教示平台能够在此前难以处理的微生物物种中进行HTP微生物基因组工程改造。
技术介绍
人类利用微生物细胞生物合成路径产生所关注的产物的能力已有一千年，所述产物的最古老实例包括乙醇、醋...
【技术保护点】
1.一种使糖多孢菌属微生物进化以获得所期望表型的高通量(HTP)基因组工程改造方法，其包含：/na.扰动具有相同基因组菌株背景的初始多种糖多孢菌微生物的基因组，由此创建包含具有独特基因变异的个别糖多孢菌菌株的初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库；/nb.针对所期望表型筛选和选择所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的个别糖多孢菌菌株；/nc.提供各自包含独特基因变异组合的后续多种糖多孢菌微生物，所述基因变异选自前一步骤中所筛选的至少两种个别糖多孢菌菌株中所存在的所述基因变异，由此创建后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库；/nd.针对所期望表型筛选和选择所述后续HTP基因设计糖...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170606 US 62/515,9341.一种使糖多孢菌属微生物进化以获得所期望表型的高通量(HTP)基因组工程改造方法，其包含：
a.扰动具有相同基因组菌株背景的初始多种糖多孢菌微生物的基因组，由此创建包含具有独特基因变异的个别糖多孢菌菌株的初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库；
b.针对所期望表型筛选和选择所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的个别糖多孢菌菌株；
c.提供各自包含独特基因变异组合的后续多种糖多孢菌微生物，所述基因变异选自前一步骤中所筛选的至少两种个别糖多孢菌菌株中所存在的所述基因变异，由此创建后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库；
d.针对所期望表型筛选和选择所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的个别糖多孢菌菌株；和
e.按照线性或非线性方式重复步骤c)-d)一次或多次，直到糖多孢菌微生物已获得所期望表型为止，其中每次后续迭代创建了新的HTP基因设计糖多孢菌菌株文库，所述新的HTP基因设计糖多孢菌菌株文库包含具有独特基因变异的个别糖多孢菌菌株，所述独特基因变异是选自前一HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的至少两种个别糖多孢菌菌株的基因变异组合。
2.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中在步骤(b)中组合所述基因变异之前，不考虑含有所述基因变异的所述基因的功能和/或特性。
3.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中待组合的至少一种基因变异不在含有编码DNA模块的重复区段的基因组区域内。
4.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中通过以下产生步骤(c)中各自包含独特基因变异组合的所述后续多种糖多孢菌微生物：
1)将质粒引入到属于所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库的个别糖多孢菌菌株中，其中所述质粒包含选择标记；反向选择标记；与基本糖多孢菌菌株的基因组基因座具有同源性的DNA片段；及质粒骨架序列，其中所述DNA片段具有源自也属于所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库的另一个别糖多孢菌菌株的基因变异；
2)基于所述基因组中存在所述选择标记选择具有整合事件的糖多孢菌菌株；
3)基于不存在反向选择标记基因选择质粒骨架环出的糖多孢菌菌株。
5.根据权利要求4所述的HTP方法，其中所述质粒不包含温度敏感型复制子。
6.根据权利要求4所述的HTP方法，其中在不复制整合质粒的情况下执行选择步骤(3)。
7.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库包含至少一个选自由以下组成的群组的文库：启动子交换微生物菌株文库、SNP交换微生物菌株文库、起始/终止密码子微生物菌株文库、优化序列微生物菌株文库、终止子交换微生物菌株文库、转座子诱变微生物菌株多样性文库、核糖体结合位点微生物菌株文库、抗代谢物/发酵产物抗性文库、终止插入微生物菌株文库和其任何组合。
8.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库是所述初始HTP基因设计微生物菌株文库的完整组合糖多孢菌菌株文库。
9.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库是所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的所述基因变异所衍生的完整组合糖多孢菌菌株文库的子集。
10.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中菌株文库中的所述基因变异所衍生的所述后续HTP基因设计是前一HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的所述基因变异所衍生的完整组合微生物菌株文库。
11.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库是前一HTP基因设计糖多孢菌菌株文库中的所述基因变异所衍生的完整组合糖多孢菌菌株文库的子集。
12.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中扰动所述基因组包含利用至少一种选自由以下组成的群组的方法：随机诱变、靶向序列插入、靶向序列缺失、靶向序列置换、转座子诱变和其任何组合。
13.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述初始多种糖多孢菌微生物包含源自生产性糖多孢菌菌株的独特基因变异。
14.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述初始多种糖多孢菌微生物包含表示为S1Gen1的生产菌株微生物和表示为SnGenn的由其衍生的任何数目个后续微生物后代。
15.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述步骤c包含通过使用原生质体融合技术快速合并所述基因变异。
16.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库或所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库包含启动子交换微生物菌株文库。
17.根据权利要求16所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述启动子交换微生物菌株文库包含至少一个具有选自SEQIDNo.1到69和172到175的核苷酸序列的启动子。
18.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库或所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库包含SNP交换微生物菌株文库。
19.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库或所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库包含终止子交换微生物菌株文库。
20.根据权利要求19所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述终止子交换微生物菌株文库包含至少一个具有选自SEQIDNo.70到80的核苷酸序列的终止子。
21.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库或所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库包含转座子诱变微生物菌株多样性文库。
22.根据权利要求21所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库或所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库包含功能缺失LoF转座子和/或功能获得GoF转座子。
23.根据权利要求22所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述GoF转座子包含溶解性标签、启动子和/或反向选择标记。
24.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库或所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库包含核糖体结合位点微生物菌株文库。
25.根据权利要求24所述的HTP基因组工程改造方法，其中核糖体结合位点微生物菌株文库包含至少一个具有选自SEQIDNo.97到127的核苷酸序列的核糖体结合位点RBS。
26.根据权利要求1所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述初始HTP基因设计糖多孢菌菌株文库或所述后续HTP基因设计糖多孢菌菌株文库包含抗代谢物/发酵产物抗性文库。
27.根据权利要求26所述的HTP基因组工程改造方法，其中所述抗代谢物/发酵产物抗性文库包含对参与糖多孢菌中的刺糖菌素合成的分子有抗性的糖多孢菌菌株。
28.一种用于产生SNP交换糖多孢菌菌株文库的方法，其包含以下步骤：
a.提供参考糖多孢菌菌株和第二糖多孢菌菌株，其中所述第二糖多孢菌菌株包含选自单核苷酸多态性、DNA插入和DNA缺失的多种已鉴别基因变异，所述已鉴别基因变异不存在于所述参考糖多孢菌菌株中；和
b.扰动所述参考糖多孢菌菌株或所述第二糖多孢菌菌株的基因组，由此创建包含多种个别糖多孢菌菌株的初始SNP交换糖多孢菌菌株文库，在所述多种个别糖多孢菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种对应于选自所述参考糖多孢菌菌株与所述第二糖多孢菌菌株之间的所述多种已鉴别基因变异中的单一基因变异。
29.根据权利要求28所述的用于产生SNP交换糖多孢菌菌株文库的方法，其中扰动所述参考糖多孢菌菌株的基因组以添加所述第二糖多孢菌菌株中所发现的所述已鉴别单核苷酸多态性、DNA插入或DNA缺失中的一种或多种。
30.根据权利要求28所述的用于产生SNP交换糖多孢菌菌株文库的方法，其中扰动所述第二糖多孢菌菌株的基因组以去除所述参考糖多孢菌菌株中未发现的所述已鉴别单核苷酸多态性、DNA插入或DNA缺失中的一种或多种。
31.根据权利要求28所述的用于产生SNP交换糖多孢菌菌株文库的方法，其中具有独特基因变异的所得多种个别糖多孢菌菌株在一起包含所述参考糖多孢菌菌株和所述第二糖多孢菌菌株之间的所有所述已鉴别基因变异的完整组合文库。
32.根据权利要求28所述的用于产生SNP交换糖多孢菌菌株文库的方法，其中具有独特基因变异的所得多种个别糖多孢菌菌株在一起包含所述参考糖多孢菌菌株和所述第二糖多孢菌菌株之间的所有所述已鉴别基因变异的完整组合文库的子集。
33.一种用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其包含以下步骤：
a.提供亲代谱系糖多孢菌菌株和由其衍生的生产性糖多孢菌菌株，其中所述生产性糖多孢菌菌株包含选自单核苷酸多态性、DNA插入和DNA缺失的多种已鉴别基因变异，所述已鉴别基因变异不存在于所述亲代谱系糖多孢菌菌株中；
b.扰动所述亲代谱系糖多孢菌菌株或所述生产性糖多孢菌菌株的基因组，由此创建初始糖多孢菌菌株文库，其中所述初始文库中的每种菌株包含来自所述亲代谱系糖多孢菌菌株与所述生产性糖多孢菌菌株之间的所述已鉴别基因变异的独特基因变异；
c.针对优于参考糖多孢菌菌株的表型性能改良来筛选和选择所述初始SNP交换糖多孢菌菌株文库中的个别糖多孢菌菌株，由此鉴别出赋予表型性能改良的独特基因变异；
d.提供各自包含独特基因变异组合的后续多种微生物，所述基因变异来自前一步骤中所筛选的至少两种个别微生物菌株中所存在的所述变异，由此创建后续糖多孢菌菌株文库；
e.针对优于所述参考糖多孢菌菌株的表型性能改良来筛选和选择所述后续菌株文库中的个别菌株，由此鉴别出赋予另外表型性能改良的独特基因变异组合；和
f.按线性或非线性方式重复步骤d)-e)一次或多次，直到糖多孢菌菌株相较于所述生产性糖多孢菌菌株的表型性能展现所期望水平的改良表型性能为止，其中每次后续迭代创建了新的糖多孢菌菌株文库，其中所述新文库中的每种菌株包含基因变异，所述基因变异是选自前一文库的至少两种个别糖多孢菌菌株中的基因变异组合。
34.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述初始糖多孢菌菌株文库是包含所述亲代谱系糖多孢菌菌株与所述生产性糖多孢菌菌株之间的所有所述已鉴别基因变异的完整组合文库。
35.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述初始糖多孢菌菌株文库是包含所述参考亲代谱系糖多孢菌菌株与所述生产性糖多孢菌菌株之间的所述已鉴别基因变异的子集的完整组合文库的子集。
36.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述后续糖多孢菌菌株文库是所述初始文库的完整组合文库。
37.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述后续糖多孢菌菌株文库是所述初始文库的完整组合文库。
38.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述后续糖多孢菌菌株文库是前一文库的完整组合文库。
39.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述后续糖多孢菌菌株文库是前一文库的完整组合文库的子集。
40.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中扰动所述亲代谱系糖多孢菌菌株的基因组以添加所述生产性糖多孢菌菌株中所发现的所述已鉴别单核苷酸多态性、DNA插入或DNA缺失中的一种或多种。
41.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中扰动所述生产性糖多孢菌菌株的基因组以去除所述亲代谱系糖多孢菌菌株中未发现的所述已鉴别单核苷酸多态性、DNA插入或DNA缺失中的一种或多种。
42.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中扰动所述基因组包含利用至少一种选自由以下组成的群组的方法：随机诱变、靶向序列插入、靶向序列缺失、靶向序列置换和其组合。
43.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中重复步骤d)-e)，直到与所述生产性糖多孢菌菌株的表型性能相比，后续文库的糖多孢菌菌株的所述表型性能在测量的表型变量方面展现至少10％增加为止。
44.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中重复步骤d)-e)，直到与所述生产性糖多孢菌菌株的表型性能相比，后续文库的糖多孢菌菌株的所述表型性能在测量的表型变量方面展现至少一倍增加为止。
45.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中步骤f)的所述改良表型性能选自由以下组成的群组：所关注产物的体积生产率、所关注产物的比生产率、所关注产物的产量、所关注产物的效价和其组合。
46.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中步骤f)的所述改良表型性能是：所关注产物的生产增加或更有效，所述所关注产物选自由以下组成的群组：小分子、酶、肽、氨基酸、有机酸、合成化合物、燃料、乙醇、初级胞外代谢物、次级胞外代谢物、胞内组分分子和其组合。
47.根据权利要求46所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述所关注产物选自由以下组成的群组：刺糖菌素、多杀菌素、乙基多杀菌素、染料木素、胆碱氧化酶、香豆胺啶化合物、红霉素、伊佛霉素糖苷配基、HMG-CoA还原酶抑制剂、羧酸异构体、α-甲基甲硫氨酸、硫杂赖氨酸、α-丁酮酸盐、天冬氨酸羟肟酸盐、氮杂丝氨酸、5-氟吲哚、β-羟基正缬氨酸、浅蓝菌素、嘌呤、嘧啶和其类似物。
48.根据权利要求46所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述刺糖菌素是刺糖菌素A、刺糖菌素D、刺糖菌素J、刺糖菌素L或其组合。
49.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述已鉴别基因变异进一步包含来自启动子交换文库的人工启动子交换基因变异。
50.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其进一步包含对所述初始糖多孢菌菌株文库或后续糖多孢菌菌株文库的至少一种微生物菌株的基因组进行工程改造，以包含可操作地连接到内源糖多孢菌靶基因的来自启动子梯的一个或多个启动子。
51.根据权利要求33所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述菌株文库包含至少一个选自由以下组成的群组的文库：启动子交换微生物菌株文库、SNP交换微生物菌株文库、起始/终止密码子微生物菌株文库、优化序列微生物菌株文库、终止子交换微生物菌株文库、转座子诱变微生物菌株多样性文库、核糖体结合位点微生物菌株文库、抗代谢物/发酵产物抗性文库、终止插入微生物菌株文库和其任何组合。
52.根据权利要求51所述的用于修复和改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述菌株文库包含至少一个选自由以下组成的群组的文库：
1)包含具有选自SEQIDNo.1到69的序列的至少一个启动子的启动子交换微生物菌株文库；
2)包含具有选自SEQIDNo.70到80的序列的至少一个终止子的终止子交换微生物菌株文库；和
3)包含具有选自SEQIDNo.97到127的序列的至少一个RBS的核糖体结合位点RBS文库。
53.一种用于产生启动子交换糖多孢菌菌株文库的方法，所述方法包含以下步骤：
a.提供对于基本糖多孢菌菌株为内源的多种靶基因，和启动子梯，其中所述启动子梯包含在所述基本糖多孢菌菌株中展现不同表达谱的多个启动子；和
b.对所述基本糖多孢菌菌株的基因组进行工程改造，由此创建包含多种个别糖多孢菌菌株的初始启动子交换糖多孢菌菌株文库，在所述多种个别糖多孢菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种包含可操作地连接到对于所述基本糖多孢菌菌株为内源的所述靶基因中的一个的来自所述启动子梯的所述启动子中的一个或多个。
54.根据权利要求53所述的用于产生启动子交换糖多孢菌菌株文库的方法，其中所述多个启动子中的至少一个包含具有选自SEQIDNo.1到69的序列的启动子。
55.一种用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其包含以下步骤：
a.提供对于基本糖多孢菌菌株为内源的多种靶基因，和启动子梯，其中所述启动子梯包含在所述基本糖多孢菌菌株中展现不同表达谱的多个启动子；
b.对所述基本糖多孢菌菌株的基因组进行工程改造，由此创建包含多种个别糖多孢菌菌株的初始启动子交换糖多孢菌菌株文库，在所述多种个别糖多孢菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种包含可操作地连接到对于所述基本糖多孢菌菌株为内源的所述靶基因中的一个的来自所述启动子梯的所述启动子中的一个或多个；
c.针对优于参考糖多孢菌菌株的表型性能改良来筛选和选择所述初始启动子交换糖多孢菌菌株文库中的个别糖多孢菌菌株，由此鉴别出赋予所述表型性能改良的独特基因变异；
d.提供各自包含独特基因变异组合的后续多种糖多孢菌微生物，所述基因变异来自前一步骤中所筛选的至少两种个别糖多孢菌菌株中所存在的所述基因变异，由此创建后续启动子交换糖多孢菌菌株文库；
e.针对优于参考大肠杆菌菌株的所需表型性能改良来筛选和选择所述后续启动子交换糖多孢菌菌株文库中的个别糖多孢菌菌株，由此鉴别出赋予另外表型性能改良的独特基因变异组合；和
f.按线性或非线性方式重复步骤d)-e)一次或多次，直到糖多孢菌菌株相较于所述生产性糖多孢菌菌株的表型性能展现所期望水平的改良表型性能为止，其中每次后续迭代创建了糖多孢菌菌株的新的启动子交换糖多孢菌菌株文库，其中所述新文库中的每种菌株包含基因变异，所述基因变异是选自前一启动子交换糖多孢菌菌株文库的至少两种个别糖多孢菌菌株中的基因变异组合。
56.根据权利要求55所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换糖多孢菌菌株文库是所述初始启动子交换糖多孢菌菌株文库的完整组合文库。
57.根据权利要求55所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换糖多孢菌菌株文库是所述初始启动子交换糖多孢菌菌株文库的完整组合文库。
58.根据权利要求55所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换糖多孢菌菌株文库是所述初始启动子交换糖多孢菌菌株文库的完整组合文库的子集。
59.根据权利要求55所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换糖多孢菌菌株文库是前一启动子交换糖多孢菌菌株文库的完整组合文库。
60.根据权利要求55所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换糖多孢菌菌株文库是前一启动子交换糖多孢菌菌株文库的完整组合文库的子集。
61.根据权利要求55所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其中重复步骤d)-e)，直到与所述生产性糖多孢菌菌株的表型性能相比，后续启动子交换糖多孢菌菌株文库的糖多孢菌菌株的所述表型性能在测量的表型变量方面展现至少10％增加为止。
62.根据权利要求55所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其中重复步骤d)-e)，直到与所述生产性糖多孢菌菌株的表型性能相比，后续启动子交换糖多孢菌菌株文库的糖多孢菌菌株的所述表型性能在测量的表型变量方面展现至少一倍增加为止。
63.根据权利要求55所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其中步骤f)的所述改良表型性能选自由以下组成的群组：所关注产物的体积生产率、所关注产物的比生产率、所关注产物的产量、所关注产物的效价和其组合。
64.根据权利要求55所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其中步骤f)的所述改良表型性能是：所关注产物的生产增加或更有效，所述所关注产物选自由以下组成的群组：小分子、酶、肽、氨基酸、有机酸、合成化合物、燃料、乙醇、初级胞外代谢物、次级胞外代谢物、胞内组分分子和其组合。
65.根据权利要求64所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其中所述所关注产物选自由以下组成的群组：刺糖菌素、多杀菌素、乙基多杀菌素、染料木素、胆碱氧化酶、香豆胺啶化合物、红霉素、伊佛霉素糖苷配基、HMG-CoA还原酶抑制剂、羧酸异构体、α-甲基甲硫氨酸、硫杂赖氨酸、α-丁酮酸盐、天冬氨酸羟肟酸盐、氮杂丝氨酸、5-氟吲哚、β-羟基正缬氨酸、浅蓝菌素、嘌呤、嘧啶和其类似物。
66.根据权利要求65所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其中所述刺糖菌素是刺糖菌素A、刺糖菌素D、刺糖菌素J、刺糖菌素L或其组合。
67.根据权利要求55所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的启动子交换方法，其中所述启动子梯包含具有选自SEQIDNo.1到69的核苷酸序列的至少一个启动子。
68.一种用于产生终止子交换糖多孢菌菌株文库的方法，其包含以下步骤：
a.提供对于基本糖多孢菌菌株为内源的多种靶基因，和终止子梯，其中所述终止子梯包含在所述基本糖多孢菌菌株中展现不同表达谱的多个终止子；和
b.对所述基本糖多孢菌菌株的基因组进行工程改造，由此创建包含多种个别糖多孢菌菌株的初始终止子交换糖多孢菌菌株文库，在所述多种个别糖多孢菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种包含可操作地连接到对于所述基本糖多孢菌菌株为内源的所述靶基因中的一个的来自所述终止子梯的所述终止子中的一个或多个。
69.一种用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的终止子交换方法，其包含以下步骤：
a.提供对于基本糖多孢菌菌株为内源的多种靶基因，和终止子梯，其中所述终止子梯包含在所述基本糖多孢菌菌株中展现不同表达谱的多个终止子；
b.对所述基本糖多孢菌菌株的基因组进行工程改造，由此创建包含多种个别糖多孢菌菌株的初始终止子交换糖多孢菌菌株文库，在所述多种个别糖多孢菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种包含可操作地连接到对于所述基本糖多孢菌菌株为内源的所述靶基因中的一个的来自所述终止子梯的所述终止子中的一个或多个；
c.针对优于参考糖多孢菌菌株的表型性能改良来筛选和选择所述初始终止子交换糖多孢菌菌株文库中的个别糖多孢菌菌株，由此鉴别出赋予表型性能改良的独特基因变异；
d.提供各自包含独特基因变异组合的后续多种糖多孢菌微生物，所述独特基因变异组合来自前一步骤中所筛选的至少两种个别糖多孢菌菌株中所存在的所述基因变异，由此创建后续终止子交换糖多孢菌菌株文库；
e.针对优于所述参考糖多孢菌菌株的表型性能改良来筛选和选择所述后续终止子交换糖多孢菌菌株文库中的个别糖多孢菌菌株，由此鉴别出赋予另外表型性能改良的独特基因变异组合；和
f.按线性或非线性方式重复步骤d)-e)一次或多次，直到糖多孢菌菌株相较于所述生产性糖多孢菌菌株的表型性能展现所期望水平的改良表型性能为止，其中每次后续迭代创建了微生物菌株的新的终止子交换糖多孢菌菌株文库，其中所述新文库中的每种菌株包含基因变异，所述基因变异是选自前一文库的至少两种个别糖多孢菌菌株中的基因变异组合。
70.根据权利要求69所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的终止子交换方法，其中所述后续终止子交换糖多孢菌菌株文库是所述初始终止子交换糖多孢菌菌株文库的完整组合文库。
71.根据权利要求69所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的终止子交换方法，其中所述后续终止子交换糖多孢菌菌株文库是所述初始终止子交换糖多孢菌菌株文库的完整组合文库的子集。
72.根据权利要求69所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的终止子交换方法，其中所述后续终止子交换糖多孢菌菌株文库是前一终止子交换糖多孢菌菌株文库的完整组合文库。
73.根据权利要求69所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的终止子交换方法，其中所述后续终止子交换糖多孢菌菌株文库是前一终止子交换糖多孢菌菌株文库的完整组合文库的子集。
74.根据权利要求69所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的终止子交换方法，其中重复步骤d)-e)，直到与所述生产性糖多孢菌菌株的表型性能相比，后续终止子交换糖多孢菌菌株文库的糖多孢菌菌株的所述表型性能在测量的表型变量方面展现至少10％增加为止。
75.根据权利要求69所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的终止子交换方法，其中重复步骤d)-e)，直到与所述生产性糖多孢菌菌株的表型性能相比，后续终止子交换糖多孢菌菌株文库的糖多孢菌菌株的所述表型性能在测量的表型变量方面展现至少一倍增加为止。
76.根据权利要求69所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的终止子交换方法，其中步骤f)的所述改良表型性能选自由以下组成的群组：所关注产物的体积生产率、所关注产物的比生产率、所关注产物的产量、所关注产物的效价和其组合。
77.根据权利要求69所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的终止子交换方法，其中步骤f)的所述改良表型性能是：所关注产物的生产增加或更有效，所述所关注产物选自由以下组成的群组：小分子、酶、肽、氨基酸、有机酸、合成化合物、燃料、乙醇、初级胞外代谢物、次级胞外代谢物、胞内组分分子和其组合。
78.根据权利要求77所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的终止子交换方法，其中所述所关注产物选自由以下组成的群组：刺糖菌素、多杀菌素、乙基多杀菌素、染料木素、胆碱氧化酶、香豆胺啶化合物、红霉素、伊佛霉素糖苷配基、HMG-CoA还原酶抑制剂、羧酸异构体、α-甲基甲硫氨酸、硫杂赖氨酸、α-丁酮酸盐、天冬氨酸羟肟酸盐、氮杂丝氨酸、5-氟吲哚、β-羟基正缬氨酸、浅蓝菌素、嘌呤、嘧啶和其类似物。
79.根据权利要求78所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的终止子交换方法，其中所述刺糖菌素是刺糖菌素A、刺糖菌素D、刺糖菌素J、刺糖菌素L或其组合。
80.根据权利要求69所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的终止子交换方法，其中所述终止子梯包含具有选自SEQIDNo.70-80的核苷酸序列的至少一个终止子。
81.一种用于产生核糖体结合位点RBS糖多孢菌菌株文库的方法，其包含以下步骤：
a.提供对于基本糖多孢菌菌株为内源的多种靶基因，和RBS梯，其中所述RBS梯包含在所述基本糖多孢菌菌株中展现不同表达谱的多个RBS；和
b.对所述基本糖多孢菌菌株的基因组进行工程改造，由此创建包含多种个别糖多孢菌菌株的初始RBS糖多孢菌菌株文库，在所述多种个别糖多孢菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种包含可操作地连接到对于所述基本糖多孢菌菌株为内源的所述靶基因中的一个的来自所述RBS梯的所述RBS中的一个或多个。
82.一种用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其包含以下步骤：
a.提供对于基本糖多孢菌菌株为内源的多种靶基因，和RBS梯，其中所述RBS梯包含在所述基本糖多孢菌菌株中展现不同表达谱的多个RBS；
b.对所述基本糖多孢菌菌株的基因组进行工程改造，由此创建包含多种个别糖多孢菌菌株的初始RBS糖多孢菌菌株文库，在所述多种个别糖多孢菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种包含可操作地连接到对于所述基本糖多孢菌菌株为内源的所述靶基因中的一个的来自所述RBS梯的所述RBS中的一个或多个；
c.针对优于参考糖多孢菌菌株的表型性能改良来筛选和选择所述初始RBS糖多孢菌菌株文库中的个别糖多孢菌菌株，由此鉴别出赋予表型性能改良的独特基因变异；
d.提供各自包含独特基因变异组合的后续多种糖多孢菌菌株，所述独特基因变异组合来自前一步骤中所筛选的至少两种个别糖多孢菌菌株中所存在的所述基因变异，由此创建后续RBS糖多孢菌菌株文库；
e.针对优于所述参考糖多孢菌菌株的表型性能改良来筛选和选择所述后续RBS糖多孢菌菌株文库中的个别糖多孢菌菌株，由此鉴别出赋予另外表型性能改良的独特基因变异组合；和
f.按线性或非线性方式重复步骤d)-e)一次或多次，直到糖多孢菌菌株相较于所述生产性糖多孢菌菌株的表型性能展现所期望水平的改良表型性能为止，其中每次后续迭代创建了微生物菌株的新的RBS糖多孢菌菌株文库，其中所述新文库中的每种菌株包含基因变异，所述基因变异是选自前一文库的至少两种个别糖多孢菌菌株中的基因变异组合。
83.根据权利要求82所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述后续RBS糖多孢菌菌株文库是所述初始RBS糖多孢菌菌株文库的完整组合文库。
84.根据权利要求82所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述后续RBS糖多孢菌菌株文库是所述初始RBS糖多孢菌菌株文库的完整组合文库的子集。
85.根据权利要求82所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述后续RBS糖多孢菌菌株文库是前一RBS糖多孢菌菌株文库的完整组合文库。
86.根据权利要求82所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述后续RBS糖多孢菌菌株文库是前一RBS糖多孢菌菌株文库的完整组合文库的子集。
87.根据权利要求82所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中重复步骤d)-e)，直到与所述生产性糖多孢菌菌株的表型性能相比，后续RBS糖多孢菌菌株文库的糖多孢菌菌株的所述表型性能在测量的表型变量方面展现至少10％增加为止。
88.根据权利要求82所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中重复步骤d)-e)，直到与所述生产性糖多孢菌菌株的表型性能相比，后续RBS糖多孢菌菌株文库的糖多孢菌菌株的所述表型性能在测量的表型变量方面展现至少一倍增加为止。
89.根据权利要求82所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中步骤f)的所述改良表型性能选自由以下组成的群组：所关注产物的体积生产率、所关注产物的比生产率、所关注产物的产量、所关注产物的效价和其组合。
90.根据权利要求82所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中步骤f)的所述改良表型性能是：所关注产物的生产增加或更有效，所述所关注产物选自由以下组成的群组：小分子、酶、肽、氨基酸、有机酸、合成化合物、燃料、乙醇、初级胞外代谢物、次级胞外代谢物、胞内组分分子和其组合。
91.根据权利要求90所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述所关注产物选自由以下组成的群组：刺糖菌素、多杀菌素、乙基多杀菌素、染料木素、胆碱氧化酶、香豆胺啶化合物、红霉素、伊佛霉素糖苷配基、HMG-CoA还原酶抑制剂、羧酸异构体、α-甲基甲硫氨酸、硫杂赖氨酸、α-丁酮酸盐、天冬氨酸羟肟酸盐、氮杂丝氨酸、5-氟吲哚、β-羟基正缬氨酸、浅蓝菌素、嘌呤、嘧啶和其类似物。
92.根据权利要求91所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述刺糖菌素是刺糖菌素A、刺糖菌素D、刺糖菌素J、刺糖菌素L或其组合。
93.根据权利要求82所述的用于改良生产性糖多孢菌菌株的表型性能的方法，其中所述RBS梯包含具有选自SEQIDNo.97到127的核苷酸序列的至少一个RBS。
94.一种用于产生转座子诱变糖多孢菌菌株多样性文库的方法，其包含
a)将转座子引入一种或多种基本糖多孢菌菌株的细胞群...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·梅森，A·戈拉诺夫，P·凯利，Y·基姆，S·莫迪，N·帕苏马尔蒂，B·米基特斯，P·埃涅尔特，
申请(专利权)人：齐默尔根公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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