【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含核酸可编程DNA结合蛋白的核碱基编辑器专利技术背景核酸序列的靶向编辑，例如基因组DNA的靶向切割或特定修饰对基因组DNA的靶向引入是研究基因功能的非常有希望的方法，并且还具有提供针对人遗传病的新疗法的潜力1。理想的核酸编辑技术拥有三个特征：(1)安装期望的修饰的高效率；(2)最小的脱靶活性；和(3)能够被编程以精确编辑给定核酸中任何位点，例如人基因组内的任何位点的能力2。当前的基因组工程工具，包括工程化的锌指核酸酶(ZFN)3、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)4，和最近地RNA引导的DNA内切核酸酶Cas95实现基因组中序列特异性的DNA切割。此可编程的切割可通过非同源末端连接(NHEJ)导致切割位点处的DNA突变，或通过同源性指导的修复(HDR)导致切割位点周围的DNA替换6,7。当前技术的一个缺点是NHEJ和HDR都是随机过程，其通常导致适度的基因编辑效率以及可与期望的改变竞争的不想要的基因改变8。由于原则上可以通过实现基因组中特定位置处的特定核苷酸变化(例如，与疾病相关的基因的特定密码子中的C至T变化)治疗许多遗传疾病9，实现此类精确基因编辑的可编程方式的开发将代表强大的新研究工具以及得到基于基因编辑的人治疗剂的潜在新方法两者。专利技术概述核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)，例如成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)系统，是最近发现的原核适应性免疫系统10，其已经经过修饰以实现多种生物体中的稳健且通用的基因组工程11。CRISPR-Cas(与CRISPR相关的)系统是蛋白质-RNA...
【技术保护点】
1.融合蛋白，其包含：(i)核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)；(ii)胞苷脱氨酶域；和(iii)尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)域，其中所述napDNAbp是CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3或Argonaute蛋白。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170323 US 62/475,830;20170426 US 62/490,587;20171.融合蛋白，其包含：(i)核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)；(ii)胞苷脱氨酶域；和(iii)尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)域，其中所述napDNAbp是CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3或Argonaute蛋白。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含2、3、4或5个UGI域。
3.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)是CasX蛋白。
4.权利要求3的融合蛋白，其中所述CasX蛋白包含
(i)与SEQIDNO:29或30至少90％相同的氨基酸序列；或
(ii)SEQIDNO:29或30的氨基酸序列。
5.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)是CasY蛋白。
6.权利要求5的融合蛋白，其中所述CasY蛋白包含与SEQIDNO:31至少90％相同的氨基酸序列。
7.权利要求5或6的融合蛋白，其中所述CasY蛋白包含SEQIDNO:31的氨基酸序列。
8.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)是Cpf1或Cpf1突变体蛋白。
9.权利要求8的融合蛋白，其中所述Cpf1或Cpf1突变体蛋白包含与SEQIDNO:9-16中的任一项至少90％相同的氨基酸序列。
10.权利要求8或9的融合蛋白，其中所述Cpf1或Cpf1突变体蛋白包含SEQIDNO:9-16中任一项的氨基酸序列。
11.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)是C2cl蛋白。
12.权利要求11的融合蛋白，其中所述C2cl蛋白包含与SEQIDNO:26至少90％相同的氨基酸序列。
13.权利要求11或12的融合蛋白，其中所述C2cl蛋白包含SEQIDNO:26的氨基酸序列。
14.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)是C2c2蛋白。
15.权利要求14的融合蛋白，其中所述C2c2蛋白包含与SEQIDNO:27至少90％相同的氨基酸序列。
16.权利要求14或15的融合蛋白，其中所述C2c2蛋白包含SEQIDNO:27的氨基酸序列。
17.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)是C2c3蛋白。
18.权利要求17的融合蛋白，其中所述C2c3蛋白包含与SEQIDNO:28至少90％相同的氨基酸序列。
19.权利要求17或18的融合蛋白，其中所述C2c3蛋白包含SEQIDNO:28的氨基酸序列。
20.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)是Argonaute蛋白。
21.权利要求20的融合蛋白，其中所述Argonaute蛋白包含与SEQIDNO:25至少90％相同的氨基酸序列。
22.权利要求20或21的融合蛋白，其中所述Argonaute蛋白包含SEQIDNO:25的氨基酸序列。
23.权利要求1-22中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域是来自载脂蛋白BmRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶的脱氨酶。
24.权利要求23的融合蛋白，其中所述APOBEC家族脱氨酶选自下组：APOBEC1脱氨酶、APOBEC2脱氨酶、APOBEC3A脱氨酶、APOBEC3B脱氨酶、APOBEC3C脱氨酶、APOBEC3D脱氨酶、APOBEC3F脱氨酶、APOBH3G脱氨酶和APOBEC3H脱氨酶。
25.权利要求1-24中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域包含与SEQIDNO:49-84的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列。
26.权利要求1至25中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域包含SEQIDNO:49-84的氨基酸序列。
27.权利要求1-22中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域是大鼠APOBEC1(rAPOBEC1)脱氨酶，其包含一个或多个选自下组的突变：SEQIDNO:76的W90Y、R126E和R132E，或另一种APOBEC脱氨酶中的一个或多个相应突变。
28.权利要求1-22中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域是人APOBEC1(hAPOBEC1)脱氨酶，其包含一个或多个选自下组的突变：SEQIDNO:74的W90Y、Q126E和R132E，或另一种APOBEC脱氨酶中的一个或多个相应突变。
29.权利要求1-22中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域是人APOBEC3G(hAPOBEC3G)脱氨酶，其包含一个或多个选自下组的突变：SEQIDNO:60的W285Y、R320E和R326E，或另一种APOBEC脱氨酶中的一个或多个相应突变。
30.权利要求1-22中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域是激活诱导的脱氨酶(AID)。
31.权利要求1-22中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域是来自海七鳃鳗(Petromyzonmarinus)的胞苷脱氨酶1(pmCDA1)。
32.权利要求1-31中任一项的融合蛋白，其中所述UGI域包含能够抑制UDG活性的域。
33.权利要求1-32中任一项的融合蛋白，其中所述UGI域包含与SEQIDNO:134至少85％相同的氨基酸序列。
34.权利要求1-32中任一项的融合蛋白，其中所述UGI域包含以SEQIDNO:134所示的氨基酸序列。
35.权利要求1-33中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下结构：
NH2-[胞苷脱氨酶域]-[napDNAbp]-[UGI域]-COOH；
NH2-[胞苷脱氨酶域]-[napDNAbp]-[UGI]-[UGI]-COOH；
NH2-[胞苷脱氨酶域]-[napDNAbp]-[UGI]-COOH；
NH2-[UGI]-[Apobec]-[napDNAbp]-COOH；
NH2-[胞苷脱氨酶域]-[UGI]-[napDNAbp]-COOH；
NH2-[napDNAbp]-[UGI]-[胞苷脱氨酶域]-COOH；或
NH2-[napDNAbp]-[胞苷脱氨酶域]-[UGI]–COOH；
其中“-”的每个情况包括任选的接头。
36.权利要求34中任一项的融合蛋白，其中(ii)的胞苷脱氨酶域和(i)的napDNAbp域经由接头连接，所述接头包含以下基序或其组合：氨基酸序列(GGGS)n(SEQIDNO:613)、(GGGGS)n(SEQIDNO:607)、(G)n(SEQIDNO:608),(EAAAK)n(SEQIDNO:609)、(GGS)n(SEQIDNO:610)、(SGGS)n(SEQIDNO:606)、SGSETPGTSESATPES(SEQIDNO:604)或(XP)n(SEQIDNO:611)，其中n独立地是1和30之间的整数，包括1和30，且其中X是任意氨基酸。
37.权利要求1-35中任一项的融合蛋白，其中(ii)的胞苷脱氨酶域和(i)的napDNAbp经由包含氨基酸序列SGSETPGTSESATPES(SEQIDNO:604)的接头连接。
38.权利要求1-36中任一项的融合蛋白，其还包含核定位序列(NLS)。
39.权利要求37的融合蛋白，其中所述NLS包含氨基酸序列PKKKRKV(SEQIDNO:614)、MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(SEQIDNO:615)或KRTADGSEFEPKKKRKV(SEQIDNO:740)。
40.权利要求37或38的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下结构：
NH2-[胞苷脱氨酶域]-[napDNAbp]-[UGI域]-[NLS]-COOH，且其中“-”的每个情况包含任选的接头。
41.权利要求37-39中任一项的融合蛋白，其中所述UGI域和所述NLS经由包含氨基酸序列SGGS(SEQIDNO:606)的接头连接，或其中所述napDNAbp和所述UGI域经由包含氨基酸序列SGGS(SEQIDNO:606)的接头连接。
42.复合物，其包含权利要求1-40中任一项的融合蛋白和与所述融合蛋白的napDNAbp结合的引导RNA。
43.方法，其包括使核酸分子与权利要求1-40中任一项的融合蛋白和引导RNA接触，其中所述引导RNA包含至少10个连续核苷酸的序列，该序列与生物体的基因组中的靶序列互补，并且包含靶碱基对。
44.权利要求42的方法，其中所述靶碱基对包含与疾病或病症相关的T至C点突变，并且其中所述突变体C碱基的脱氨基导致与疾病或病症无关的序列。
45.权利要求42或43的方法，其中所述接触导致在碱基编辑后小于20％的插入/缺失形成。
46.权利要求42-44中任一项的方法，其中所述接触导致碱基编辑后至少2:1的意图与非意图产物。
47.复合物，其包含权利要求1-40中任一项的融合蛋白和与所述napDNAbp结合的RNA。
48.权利要求46的复合物，其中所述RNA是引导RNA(gRNA)。
49.权利要求46的复合物，其中所述RNA是非编码RNA，和/或其中所述RNA包含SEQIDNO:741的氨基酸序列，其中SEQIDNO:741的每个T是尿嘧啶(U)。
50.权利要求46的复合物，其中所述RNA是微小RNA(miRNA)。
51.权利要求46的复合物，其中所述RNA是小干扰RNA(siRNA)。
52.权利要求46的复合物，其中所述RNA是Piwi相互作用RNA(piRNA)。
53.权利要求46-51中任一项的复合物，其中所述RNA长为10-100个核苷酸，并且包含与靶序列互补的至少10个连续核苷酸的序列。
54.权利要求52的复合物，其中所述RNA长为10、11、12、13、14,15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
55.权利要求46-53中任一项的复合物，其中所述RNA包含与靶序列互补的15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续核苷酸的序列。
56.权利要求46-54中任一项的复合物，其中所述靶序列是DNA序列。
57.权利要求46-54中任一项的复合物，其中所述靶序列是RNA序列。
58.权利要求55的复合物，其中所述靶序列在生物体的基因组中。
59.权利要求56的复合物，其中所述靶序列是从生物体的基因组转录的。
60.权利要求57或58的复合物，其中所述生物体是原核生物。
61.权利要求59的复合物，其中所述原核生物是细菌。
62.权利要求57或58的复合物，其中所述生物体是真核生物。
63.权利要求61的复合物，其中所述生物体是植物。
64.权利要求61的复合物，其中所述生物体是脊椎动物。
65.权利要求63的复合物，其中所述脊椎动物是哺乳动物。
66.权利要求64的复合物，其中所述哺乳动物是小鼠或大鼠。
67.权利要求64的复合物，其中所述哺乳动物是人。
68.方法，其包括使核酸分子与权利要求46-66中任一项的复合物接触。
69.权利要求67的方法，其中所述核酸是DNA。
70.权利要求68的方法，其中所述核酸是双链DNA。
71.权利要求67的方法，其中所述核酸是RNA。
72.权利要求70的方法，其中所述RNA是mRNA。
73.权利要求67-71中任一项的方法，其中所述核酸包含与疾病或病症相关的靶序列。
74.权利要求72的方法，其中所述靶序列包括与疾病或病症相关的点突变。
75.权利要求73的方法，其中所述融合蛋白或所述复合物的活性导致所述点突变的校正。
76.权利要求73-74中任一项的方法，其中所述靶序列包含与疾病或病症相关的T至C点突变，并且其中所述突变体C碱基的脱氨基导致与疾病或病症无关的序列。
77.权利要求75的方法，其中所述靶序列编码蛋白质，并且其中所述点突变在密码子中，并且与野生型密码子相比导致由所述突变体密码子编码的氨基酸的变化。
78.权利要求75或76的方法，其中所述突变体C的脱氨基导致所述突变体密码子编码的氨基酸的变化。
79.权利要求75或76的方法，其中所述突变体C的脱氨基导致编码野生型氨基酸的密码子。
80.权利要求67-78中任一项的方法，其中所述接触在受试者的体内进行。
81.权利要求67-78中任一项的方法，其中所述接触在体外进行。
82.权利要求79的方法，其中所述受试者已经被诊断出患有疾病或病症。
83.权利要求72-82中任一项的方法，其中所述疾病或病症是囊性纤维化(cysticfibrosis)、苯丙酮尿症(phenylketonuria)、表皮松解角化过度症(epidermolytichyperkeratosis)(EHK)、夏科-马里-图思病(Charcot-Marie-Tootdisease)4J型、神经母细胞瘤(neuroblastoma)(NB)、血管性血友病(vonWillebranddisease)(vWD)、先天性肌强直(myotoniacongenital)、遗传性肾淀粉样变性(hereditaryrenalamyloidosis)、扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy)(DCM)、遗传性淋巴水肿(hereditarylymphedema)、家族性阿尔茨海默氏病、HIV、朊病毒病(Priondisease)、慢性婴儿神经系统皮肤关节综合征(chronicinfantileneurologiccutaneousarticularsyndrome)(CINCA)、结蛋白相关性肌病(desmin-relatedmyopathy)(DRM)、与PI3KCA突变体蛋白、CTNNB1突变体蛋白、HRAS突变体蛋白或p53突变体蛋白相关的肿瘤性疾病(neoplasticdisease)。
84.包含核酸构建体的试剂盒，所述核酸构建体包含
(a)编码权利要求1-40中任一项的融合蛋白的核酸序列；和
(b)驱动(a)的序列表达的异源启动子。
85.权利要求83的试剂盒，其进一步包含编码引导RNA主链的表达构建体，其中所述构建体包含克隆位点，所述克隆位点定位为允许将与靶序列相同或互补的核酸序列克隆到所述引导RNA主链中。
86.编码权利要求1-40中任一项的融合蛋白的多核苷酸。
87.载体，其包含权利要求85的多核苷酸。
88.权利要求86的载体，其中所述载体包含驱动所述多核苷酸表达的异源启动子。
89.细胞，其包含权利要求1-40中任一项的融合蛋白。
90.细胞，其包含权利要求46-66中任一项的复合物。
91.细胞，其包含编码权利要求1-40中任一项的融合蛋白的核酸分子。
92.用于产生核糖核蛋白(RNP)复合物的方法，所述方法包括：
(i)在水性溶液中将碱基编辑器蛋白与RNA复合，从而在所述水性溶液中形成包含所述碱基编辑器和所述RNA的复合物；并且
(ii)使(i)的复合物与阳离子脂质接触。
93.权利要求91的方法，其中(i)的所述碱基编辑器蛋白和所述RNA以1:1至1:1.5的摩尔比复合。
94.权利要求91或92的方法，其中(i)的所述碱基编辑器蛋白和所述RNA以1:1.05至1:1.2的摩尔比复合。
95.权利要求91-93中任一项的方法，其中(i)的所述碱编辑蛋白和所述RNA以约1:1.1的摩尔比复合。
96.权利要求91-94中任一项的方法，其中(i)的所述碱编辑蛋白和所述RNA以1:1.1的摩尔比复合。
97.权利要求91-95中任一项的方法，其中所述碱基编辑器蛋白以10μM至100μM的浓度存在于所述水性溶液中。
98.权利要求91-96中任一项的方法，其中所述碱基编辑器蛋白以20μM至50μM的浓度存在于所述水性溶液中。
99.权利要求91-97中任一项的方法，其中所述碱基编辑器蛋白以30μM至40μM的浓度存在于所述水性溶液中。
100.权利要求91-98中任一项的方法，其中所述碱基编辑器蛋白以11μM至110μM的浓度存在于所述水性溶液中。
101.权利要求91-99中任一项的方法，其中所述碱基编辑器蛋白以22μM至55μM的浓度存在于所述水性溶液中。
102.权利要求91至100中任一项的方法，其中所述碱基编辑器蛋白以33μM至44μM的浓度存在于所述水性溶液中。
103.权利要求91-101中任一项的方法，其中所述RNA是sgRNA。
104.权利要求91-102中任一项的方法，其中使(i)的所述水性溶液中的所述复合物与(ii)的所述阳离子脂质以1:2至2:1的体积比接触。
105.权利要求91-103中任一项的方法，其中使(i)的所述水性溶液中的所述复合物与(ii...
【专利技术属性】
技术研发人员：DR刘，AC科摩，L陈，HA里斯，
申请(专利权)人：哈佛大学的校长及成员们，
类型：发明
国别省市：美国;US
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