一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法。本发明专利技术的克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法，包括步骤：1)选取细菌一；2)扩增细菌一的部分异戊烯转移酶基因引物采用第一简并引物，模板为细菌一的基因组；3)将扩增得到的部分异戊烯转移酶基因做比对，获得亲缘关系最近的菌种并获得其的完整异戊烯转移酶的基因序列；4)根据亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶基因序列设计第二简并引物，扩增细菌一的完整异戊烯转移酶基因，模板为细菌一的基因组；5)按照该方法依次得到多个细菌的完整异戊烯转移酶基因，建构异戊烯转移酶基因家族成员群。本发明专利技术的方法能够获取大量的异戊烯转移酶基因家族成员。

A method of cloning isopentenyltransferase gene family members

【技术实现步骤摘要】
一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法。
技术介绍
异戊烯转移酶是他汀类药物生产的重要催化剂，获取异戊烯转移酶基因家族成员群能为异戊烯转移酶基因研究和他汀类药物生产提供丰富的候选基因资源。目前，克隆异戊烯转移酶基因家族成员的方法是首先在基因库中寻找异戊烯转移酶基因序列，然后根据异戊烯转移酶基因序列设计引物克隆异戊烯转移酶基因；这种方法获取的异戊烯转移酶基因十分有限，仅局限于基因库中已公开的异戊烯转移酶基因，不能获取未公开在基因库中异戊烯转移酶基因，不能全面获取异戊烯转移酶基因家族成员。
技术实现思路
为了解决以上问题，本专利技术的目的是提供一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法，能够获取大量的异戊烯转移酶基因家族成员，为异戊烯转移酶基因研究和他汀类药物生产提供丰富的候选基因资源。为实现上述目的，本专利技术所设计的克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法，包括步骤：(1)选取细菌一；(2)利用PCR技术扩增细菌一的部分异戊烯转移酶基因，PCR扩增技术中引物采用第一简并引物，第一简并引物的上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示，模板为细菌一的基因组DNA；(3)将扩增得到的部分异戊烯转移酶基因做BLAST比对，获得亲缘关系最近的菌种并获得亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶的基因序列；(4)根据步骤(3)亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶基因序列设计第二简并引物，利用PCR技术扩增细菌一的完整异戊烯转移酶基因，该步骤的PCR扩增技术中引物为第二简并引物，模板为细菌一的基因组DNA；(5)再选取细菌二，按照上述步骤(2)至步骤(4)的方法获取细菌二的完整异戊烯转移酶基因，按照该方法依次得到多个细菌的完整异戊烯转移酶基因，建构异戊烯转移酶基因家族成员群。作为优选方案，所述步骤2)和步骤4)中PCR扩增体系为10×PCR反应缓冲液5μl、25mmol/LMgso42μl、10mmoldNTP5μl、10nmol/L引物各1μl、模板80ng、KoD-PlusDNA聚合酶1μl、双蒸去离子水定容至50μl；反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。本专利技术的优点在于：本专利技术利用第一简并引物克隆出细菌一异戊烯转移酶基因的部分碱基序列，将扩增得到的部分异戊烯转移酶基因做BLAST比对获得亲缘关系最近的菌种并确定亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶基因的序列，根据该异戊烯转移酶基因的序列设计第二简并引物，利用第二简并引物和基因组DNA，扩增得到细菌一的完整异戊烯转移酶基因基因。采用这种方法能得到大量的完整异戊烯转移酶基因序列，相比于基因库中的异戊烯转移酶基因，本专利技术能得到基因库中未公开的异戊烯转移酶基因，显著增加了异戊烯转移酶基因的种类，为异戊烯转移酶研究和他汀类药物生产提供丰富的候选基因资源。附图说明图1为Cryobacteriumsp.GCJ06细菌的部分异戊烯转移酶基因的核酸电泳图；图2为Cryobacteriumsp.GCJ06细菌的完整异戊烯转移酶基因的和核酸电泳图；图3为重组表达质粒pET21a-AKR构建示意图；图4为4个菌种的异戊烯转移酶基因碱基序列比对图。具体实施方式为更好地理解本专利技术，以下将结合附图和具体实例对专利技术进行详细的说明。克隆异戊烯转移酶基因家族成员的方法，包括步骤：(1)选取细菌一：细菌Cryobacteriumsp.GCJ06；(2)利用PCR技术扩增Cryobacteriumsp.GCJ06细菌的部分异戊烯转移酶基因，PCR扩增技术中引物采用第一简并引物，第一简并引物的上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示，模板为细菌一的基因组DNA；2.1)第一简并引物碱基序列的设计过程：利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库，以“Al/ketoreductase”为检索词，进行“Nucleotide”及“Protein”检索，获得多条多条异戊烯转移酶基因蛋白序列及编码基因序列，分别下载蛋白氨基酸序列，并进入IdenticalProteins引导界面中CDSRegioninNucleotide下载相对应核酸序列，为了避免赘述，本专利技术仅罗列Cryobacteriumsp.MLB-32、Cryobacteriumroopkundense、Agromycessp.Leaf222、marineactinobacteriumPHSC20C14个菌种的异戊烯转移酶基因碱基序列，需要说明的是，本专利技术实际进行了10个以上的菌种的异戊烯转移酶碱基序列对比，以确保得到的保存序列的准确性。Cryobacteriumsp.MLB-32的异戊烯转移酶基因碱基序列如SEQIDNO.3所示，Cryobacteriumroopkundense的异戊烯转移酶基因碱基序列如SEQIDNO.4所示，Agromycessp.Leaf222contig_1的异戊烯转移酶基因碱基序列如SEQIDNO.5所示，marineactinobacteriumPHSC20C1的异戊烯转移酶基因碱基序列如SEQIDNO.6所示；将上述4条异戊烯转移酶基因碱基序列进行比对，如图4所示，图4中框线中为4条异戊烯转移酶基因碱基序列的高度保守序列。根据高度保守序列设计得到第一简并引物，第一简并引物的上游引物：CGGGATCCAGCTGGRTSAAYACVGC；下游引物：GGAATTCRTCYTGMACVGCNCCGAA。引物碱基序列中“S”＝C/G、“R”＝A/G、“N”＝A/C/G/T、“Y”＝C/T和“V”＝A/C/G“M”＝A/C。2.2)提取细菌的基因组DNA作为模板：细菌的基因组DNA按照常规细菌基因组DNA操作进行，提取细菌的基因组DNA属于分子生物领域的常规技术手段，在此不再赘述。2.3)PCR扩增PCR扩增体系为10×PCR反应缓冲液5μl、25mmol/LMgso42μl、10mmoldNTP5μl、10nmol/L第一简并引物(上游引物和下游引物)各1μl、模板80ng、KoD-PlusDNA聚合酶1μl、双蒸去离子水定容至50μl；反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。将如图1所示的PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收，克隆测序，测序由ABI3100测序仪完成。测序后获得部分异戊烯转移酶基因序列如SEQIDNO.7所示。(3)获得与Cryobacteriumsp.GCJ06细菌亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶基因序列：将扩增得到的部分异戊烯转移酶基因做本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的简并引物，其特征在于，所述简并引物的上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的简并引物，其特征在于，所述简并引物的上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示。


2.一种克隆异戊烯转移酶基因家族成员群的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)选取细菌一；
(2)利用PCR技术扩增细菌一的部分异戊烯转移酶基因，PCR扩增技术中引物采用第一简并引物，第一简并引物的上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示，模板为细菌一的基因组DNA；
(3)将扩增得到的部分异戊烯转移酶基因做BLAST比对，获得亲缘关系最近的菌种并获得亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶的基因序列；
(4)根据步骤(3)亲缘关系最近菌种的完整异戊烯转移酶基因序列设计第二简并引物，利用PCR技术扩增细菌一的完整异戊烯...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫春杰，王崇鞠，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42