一种轨道再生型DNA步行器及应用制造技术

本公开属于DNA步行器的构建技术领域，具体涉及一种轨道再生型DNA步行器及应用。本公开提出了一种轨道再生型DNA步行器的概念并对其进行了验证。该步行器采用由路基和路轨组成的可分离的轨道。其路基链功能化于金纳米颗粒上，而大量的路轨链游离于溶液中并会与路基链杂交以构建轨道。随着步行器沿着轨道行走，路轨链被酶切同时释放出路基链，而释放出来的路基链则会继续结合溶液中的路轨链来形成新的轨道。轨道的持续补给使得机器可以保持行走。该机器在信号富集方面具有很大的优势，因此可以用于血清中埃博拉病毒基因片段的灵敏检测。

A kind of DNA walker with orbit regeneration and its application

【技术实现步骤摘要】
一种轨道再生型DNA步行器及应用
本公开属于DNA步行器的构建
，具体涉及一种轨道可再生的DNA步行器以及该步行器及其在生物传感中的应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。DNA分子机器是一类由DNA组装而成的在微米或者纳米尺度上执行类机器行为的分子机器。受益于DNA分子独特的性质，如严格的碱基互补配对，优异的识别能力以及高度编程性等，DNA分子机器可以被精确控制，并且可以响应多种刺激，进行精细操作。迄今为止，已经构建了各种类型的DNA分子机器，包括步行器、镊子、齿轮、转子、传送带等。其中，DNA步行器在响应外部刺激后，可以沿着预先设计的一维、二维或三维轨道自主渐进行走。然而，在已有的DNA步行器的设计中，随着步行链的行走，其供步行链行走的轨道会因为链取代而被占位或者水解被消耗而逐渐耗尽，这严重限制了步行器行走的步数，不利于步行器沿着轨道持续运行。
技术实现思路
基于上述研究背景，本公开报道了一种新式的DNA步行器，它可以沿着再生的轨道自主持续行走。不同于已有的轨道耗尽型步行器，该步行器可以通过补给轨道组分来再生用于行走的轨道。其轨道是路轨和路基的组合。具体而言，它是由路基链和路轨链杂交构成的。当步行链沿着轨道行走时，构成轨道的路轨链被消耗，随之释放出路基链，释放出的路基链会继续结合溶液中游离的路轨链构成新的轨道，这就是轨道的再生过程。步行器沿着这样的可再生的轨道行走有效地提高了行走步数，提高了其持续运行性。并且该步行器表现出优异的信号放大能力，可用于目标物的灵敏检测。基于上述研究成果，本公开提供以下技术方案：本公开第一方面，提供一种轨道再生型DNA步行器，所述DNA步行器由金纳米颗粒(AuNP)表面连接至少一条步行链及若干条路基链；所述步行链及路基链均为单链DNA，步行链的一端与金纳米颗粒连接，另一端为通过封闭链封闭；所述路基链的一端与金纳米颗粒连接；所述轨道再生型DNA步行器还包括补充组件路轨链及核酸外切酶，所述路轨链为发卡结构，其5’凹末端和3’端分别修饰荧光基团和猝灭基团。该轨道再生型DNA步行器的运行原理如原理1所示。它包含修饰有数十条路基链和较少量的被封闭链沉默的步行链的AuNP，以及大量路轨链，其5’凹末端和3’端分别修饰了FAM荧光基团和BHQ1猝灭基团。并且路轨链以发夹的形式游离于溶液中，此时荧光被猝灭。路轨链可以与路基链杂交以暴露出原本封于颈部的区域来结合步行链。特定的目标链通过竞争性结合与封闭链形成更稳定的双链从而释放出步行链，激活该步行器。释放出的步行链则会杂交轨道中的路轨链暴露出的区域，形成一个三链复合体。路轨链的3’凸末端变为3’凹末端，从而使得路轨链被核酸外切酶(ExoIII)逐步切割消化，导致轨道的消耗。同时释放出步行链和路基链，而被AuNP猝灭荧光的荧光基团也被释放出，恢复荧光。然后释放出来的步行链继续结合下一个轨道上的路轨链，而释放出来的路基链则继续与游离的路轨链结合形成新的轨道以供步行链行走。在这个过程中，只要溶液中存在用于补给的路轨链，轨道就可以再生以弥补消耗的轨道，而该DNA步行器就可以沿着轨道多周运行。优选的，所述金纳米颗粒的直径为10～20nm。优选的，所述金纳米颗粒：步行链：路基链的摩尔比为0.8～1.2:8～12:180～220.优选的，所述步行链与路基链为硫醇化的DNA单链。优选的，所述路轨链的浓度范围为小于等于1μM。进一步优选的，所述浓度范围为0-600nM。本公开提供的轨道再生型步行器，通过路轨链与路基链的不断杂交形成新的轨道来实现轨道再生，技术人员可通过补充路轨链的数量来维持步行链的行走，当待测环境中路轨链的浓度为1μM时达最大的信噪比，当浓度保持在0nM至600nM的范围内，荧光强度随路轨链浓度的增加而成比例地增长，呈现出良好地线性关系，这表明在该范围内轨道的切割和再生是彻底的。本公开第二方面，提供第一方面所述轨道再生型DNA步行器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将硫醇化的路基链及被封闭的步行链加入金纳米颗粒溶液中在室温条件下摇动一段时间。优选的，所述被封闭的步行链制备方法如下：将步行链和封闭链的混合物在85～95℃中加热8～12分钟，然后缓慢冷却至室温。优选的，所述路基链：被封闭链锁定的步行链：路基链的比例为0.8～1.2:8～12:180～210。优选的，所述制备方法还包括：摇动完成后，向混合物中加入tween-20摇动一段时间之后，再向混合物中缓慢加入NaCl继续摇动。进一步优选的，所述tween-20的浓度为0.8～1.2％(体积分数)。进一步优选的，所述NaCl的添加速度为6小时内缓慢添加2MNaCl。进一步优选的，采用PBS洗涤最终混合物。本公开第三方面，提供第一方面所述轨道再生型DNA步行器在制备核酸生物传感器中的应用。本公开第四方面，提供一种核酸生物传感器，所述传感器采用第一方面所述轨道再生型DNA进行信号放大。本公开第五方面，提供一种核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括第一方面所述轨道再生型DNA步行器。依据该步行器工作原理，本领域技术人员可以设计与待测核酸物质具有更好杂交稳定性的单链作为封闭链，向待测核酸物质中加入该步行器后，所述封闭链由于与待测物质具有更好的杂交稳定性从而与步行器解离释放出步行链。通过控制待测环境中路轨链的数量来控制信噪比，从而确定信号放大倍数。与现有技术相比，本公开的有益效果是：本公开提供了一种轨道再生型DNA步行器。与已报道的在行走过程中逐步消耗其轨道直至耗尽的DNA步行器相比，新型DNA步行器可以在步行链行走后，通过将路轨链补充到路基链上来重新生成轨道以保持其移动。这种轨道再生型DNA步行器具有多个优势。首先，只要溶液中存在可用于补充的路轨链，就可以在切割后重建轨道，这使DNA步行者能够增加步行步数，增强其持续运行性。其次，它比轨道耗尽型DNA步行器的速度高一个数量级，从而提高了其工作效率。第三，在步行过程中产生累积信号的特性使步行者能够检测到痕量目标。该DNA步行器是获得高持续运行性的DNA分子机器的重要一步，并且具有进一步扩展DNA分子机器应用的潜力，例如基于DNA的灵敏传感，增强的分子成像和快速的药物递送。附图说明构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。图1为轨道再生型DNA步行器的运行原理图；图2为AuNPs的表征结果图；其中，图2a)为紫外-可见光谱图，图2b)为TEM图谱。图3为AuNPs与DNA-AuNPs的表征结果图；图3a)为紫外-可见光谱图，图3b)为DLS图谱。图4为路基链的荧光-浓度标准曲线图；其中，插入图为D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种轨道再生型DNA步行器，其特征在于，所述DNA步行器由金纳米颗粒表面连接至少一条步行链及若干条路基链；所述步行链及路基链均为单链DNA，步行链的一端与金纳米颗粒连接，另一端为通过封闭链封闭；所述路基链的一端与金纳米颗粒连接；所述轨道再生型DNA步行器还包括补充组件路轨链及核酸外切酶，所述路轨链为发卡结构，其5’凹末端和3’端分别修饰荧光基团和猝灭基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种轨道再生型DNA步行器，其特征在于，所述DNA步行器由金纳米颗粒表面连接至少一条步行链及若干条路基链；所述步行链及路基链均为单链DNA，步行链的一端与金纳米颗粒连接，另一端为通过封闭链封闭；所述路基链的一端与金纳米颗粒连接；所述轨道再生型DNA步行器还包括补充组件路轨链及核酸外切酶，所述路轨链为发卡结构，其5’凹末端和3’端分别修饰荧光基团和猝灭基团。


2.如权利要求1所述轨道再生型DNA步行器，其特征在于，所述金纳米颗粒的直径为10～20nm；或所述金纳米颗粒：步行链：路基链的比例为0.8～1.2:8～12:180～220。


3.如权利要求1所述轨道再生型DNA步行器，其特征在于，所述步行链与路基链为硫醇化的DNA单链；或所述路轨链的浓度范围为小于等于1μM。


4.权利要求1-3任一项所述轨道再生型DNA步行器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将硫醇化的路基链及被封闭的步行链加入金纳米颗粒溶液中在室温条件下摇动一段时间。


5.如权利要求4所述轨道再生型DNA步行器的...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜玮，徐晓文，逄寒，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37