一种优化的大片段DNA提取方法技术

提供了一种大片段DNA的提取方法，包括三个步骤：（1）样品研磨与裂解：其中使用了包含PVP、焦亚硫酸钠、氯化钠、Tris、EDTA和SDS的第一溶液和核糖核酸酶A；（2）抽提：分别使用了5M醋酸钠的第二溶液，包含PEG8000和氯化钠的第三溶液后，再用氯仿/异戊醇抽提；（3）沉淀与清洗。该方法可用于解决多糖多酚物种的提取难题，提取样品完整性大于40kb。

An optimized extraction method of large DNA fragments

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种优化的大片段DNA提取方法
本专利技术涉及DNA提取
，具体涉及一种优化的大片段DNA提取方法。
技术介绍
现有的DNA提取技术包括CTAB法、盐析法、Meta柱提取法、美基试剂盒提取法等。以上提取方法适用于DNA较容易提取的物种，对于DNA难提取的物种，以上方法并没有太大的优势，存在一定的物种局限性。尤其是，多糖多酚物种难提取，提取DNA的完整性小于40Kb，无法满足一些项目需求，如第三代全基因组测序等；辣椒、樱桃等物种难以采用传统的CTAB法提取。
技术实现思路
本专利技术提供一种优化的大片段DNA提取方法，解决多糖多酚物种的提取难题，提取的样品完整性大于40kb，能够满足三代测序对样品的要求。本专利技术包括如下技术方案：一种优化的大片段DNA提取方法，包括如下步骤：(1)样品研磨与裂解：将样品于液氮中研磨至粉末，加入第一溶液和核糖核酸酶A，孵育一段时间后离心；其中，上述第一溶液包含PVP、焦亚硫酸钠、氯化钠、pH8.0的1M Tris、0.5M EDTA、20％SDS；(2)抽提：裂解完毕后，加入第二溶液，孵育一段时间后离心；取上清、加入第三溶液，混匀后离心；取上清、加入体积比为24：1的氯仿/异戊醇，混匀后离心；其中，上述第二溶液包含5M醋酸钾，上述第三溶液包含PEG8000、氯化钠；(3)沉淀与清洗：取上清、加入异丙醇，颠倒混匀后低温放置2h以上；离心、弃上清，加入乙醇悬浮沉淀，离心、弃上清，风干后加入洗脱液使沉淀完全溶解。进一步地，上述步骤(1)中，上述粉末用量是40～100mg。进一步地，上述步骤(1)中，上述第一溶液提前孵育至65℃；上述孵育一段时间是指在50℃孵育30min。进一步地，上述第一溶液与上述第二溶液的体积比为3：1。进一步地，上述步骤(2)中，上述第三溶液的加入量为上清的1/2体积。进一步地，上述步骤(2)中，上述氯仿/异戊醇的加入量与上清等体积。进一步地，上述步骤(3)中，上述异丙醇的加入量与上清等体积。进一步地，上述步骤(3)中，上述低温是指-20℃。进一步地，上述步骤(3)中，上述乙醇是指75％乙醇溶液。进一步地，上述离心均是在4℃下进行。本专利技术的方法通过加入第一溶液、第二溶液、第三溶液反应后，离心取上清，再结合氯仿抽提，降低多糖多酚的影响，保证了其完整性，提高样品的质量以满足三代测序的要求，并且解决特殊物种DNA难提取的问题。附图说明图1是本专利技术实施例中普通电泳结果，其中泳道1、2、3、4、5、6分别代表的物种为番茄、樱桃、樱桃、石斛(花)、石斛(叶)、鱼肉，M1、M2表示DNA Marker；图2是本专利技术实施例中脉冲电泳结果，其中泳道1、2、3、4、5、6分别代表的物种为番茄、樱桃、樱桃、石斛(花)、石斛(叶)、鱼肉，M1、M2表示DNA Marker。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本专利技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本专利技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本专利技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。本专利技术实施例中，一种优化的大片段DNA提取方法，包括如下步骤：(1)样品研磨与裂解：将样品于液氮中研磨至粉末，加入第一溶液和核糖核酸酶A(RNaseA)，孵育一段时间后离心；其中，第一溶液包含PVP、焦亚硫酸钠、氯化钠、pH8.0的1M Tris、0.5M EDTA、20％SDS；(2)抽提：裂解完毕后，加入第二溶液，孵育一段时间后离心；取上清、加入第三溶液，混匀后离心；取上清、加入体积比为24：1的氯仿/异戊醇，混匀后离心；其中，第二溶液包含5M醋酸钾，第三溶液包含PEG8000、氯化钠；(3)沉淀与清洗：取上清、加入异丙醇，颠倒混匀后低温放置2h以上；离心、弃上清，加入乙醇悬浮沉淀，离心、弃上清，风干后加入洗脱液使沉淀完全溶解。在优选的实施例中，粉末用量是40～100mg，例如，42mg、45mg、50mg、60mg、70mg、75mg、82mg、85mg、90mg、98mg等。在优选的实施例中，步骤(1)中，第一溶液提前孵育至65℃(例如提前65℃孵育30min以上)；该步骤中的“孵育一段时间”，是指在50℃孵育30min，也可以是其它温度和时间，例如55℃孵育25min、60℃孵育20min等，孵育过程中，可以每10min上下颠倒混匀。在优选的实施例中，第一溶液与第二溶液的体积比为3：1，例如，第一溶液600μL、第二溶液200μL，或者第一溶液2.5mL、第二溶液850μL等。在优选的实施例中，步骤(2)中，第三溶液的加入量为上清的1/2体积。在优选的实施例中，步骤(2)中，步骤(2)中，氯仿/异戊醇的加入量与上清等体积。在优选的实施例中，步骤(2)中，步骤(3)中，异丙醇的加入量与上清等体积。在优选的实施例中，步骤(2)中，步骤(3)中，低温是指-20℃，即在低温放置2h以上再离心。在优选的实施例中，步骤(2)中，步骤(3)中，乙醇是指75％乙醇溶液，即乙醇与水体积比为75：25的溶液。在优选的实施例中，离心均是在4℃下进行。以下通过实施例详细说明本专利技术的技术方案和效果，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本专利技术保护范围的限制。利用吉泰提取试剂盒(依科赛生物科技有限公司-长片段基因组DNA提取试剂盒(for TGS)-NGS00-5011)并结合CTAB法，提取鱼肉、石斛、樱桃、番茄植物叶片中的DNA。提取过程包括三个阶段：样品研磨以及裂解，抽提，过夜沉淀与清洗。为了提高DNA总量，本实例采用5mL管进行取样、裂解、抽提以及过夜沉淀。样品研磨裂解：使用实验室内的研钵与研磨棒，倒入适量液氮，将样品放入研钵中，研磨至粉末为白色，样品取100mg装入5mL EP管内，加入2.5mL提前65℃孵育30min以上的溶液I，并加入RNaseA 5μL，在恒温混合器中50℃孵育30min，每10min上下颠倒混匀，离心机降温为4℃。抽提：裂解完毕，加入850μL溶液Ⅱ，颠倒离心管充分混匀，在4℃放置5min，4℃，10000g，离心5min，转移上清液至另一个离心管，加入1/2体积的溶液Ⅲ1.5mL，混匀后4℃，10000g，离心5min，转移上清液至另一个离心管，注意不要碰到沉淀物。加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒混匀，12000g，离心10min。过夜沉淀与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种优化的大片段DNA提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n(1)样品研磨与裂解：将样品于液氮中研磨至粉末，加入第一溶液和核糖核酸酶A，孵育一段时间后离心；其中，所述第一溶液包含PVP、焦亚硫酸钠、氯化钠、pH8.0的1M Tris、0.5M EDTA、20％ SDS；/n(2)抽提：裂解完毕后，加入第二溶液，孵育一段时间后离心；取上清、加入第三溶液，混匀后离心；取上清、加入体积比为24：1的氯仿/异戊醇，混匀后离心；其中，所述第二溶液包含5M醋酸钾，所述第三溶液包含PEG8000、氯化钠；/n(3)沉淀与清洗：取上清、加入异丙醇，颠倒混匀后低温放置2h以上；离心、弃上清，加入乙醇悬浮沉淀，离心、弃上清，风干后加入洗脱液使沉淀完全溶解。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种优化的大片段DNA提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)样品研磨与裂解：将样品于液氮中研磨至粉末，加入第一溶液和核糖核酸酶A，孵育一段时间后离心；其中，所述第一溶液包含PVP、焦亚硫酸钠、氯化钠、pH8.0的1M Tris、0.5M EDTA、20％ SDS；
(2)抽提：裂解完毕后，加入第二溶液，孵育一段时间后离心；取上清、加入第三溶液，混匀后离心；取上清、加入体积比为24：1的氯仿/异戊醇，混匀后离心；其中，所述第二溶液包含5M醋酸钾，所述第三溶液包含PEG8000、氯化钠；
(3)沉淀与清洗：取上清、加入异丙醇，颠倒混匀后低温放置2h以上；离心、弃上清，加入乙醇悬浮沉淀，离心、弃上清，风干后加入洗脱液使沉淀完全溶解。


根据权利要求1所述的大片段DNA提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述粉末用量是40～100mg。


根据权利要求1所述的大片段DNA提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述第一溶液提前孵育至65℃；所述孵育一...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁浩，邹仕杰，钟宏彬，周媛，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44