一种利用抑制剂提取不含DNA的RNA方法技术

本发明专利技术公开了一种利用抑制剂提取不含DNA的RNA方法，本发明专利技术使用经处理的生长至一定周期的小桐子幼叶研磨上清液，与样本进行共提取，可以阻止样本中与病原体RNA同源的病原体DNA的回收，从而提高病原体RNA的提取质量。样本包括但不仅是病毒、细菌等。本发明专利技术的提取方法可以达到安全、经济、高效，不用增加时间长、成本高的DNAse I消化步骤，即可获得不含同源DNA的病原体RNA。

A method of RNA extraction without DNA by inhibitors

【技术实现步骤摘要】
一种利用抑制剂提取不含DNA的RNA方法
本专利技术属于核酸提取
，特别涉及一种利用抑制剂提取不含DNA的RNA方法。
技术介绍
核酸提取是分子生物学研究的基础技术。在一些病原体的扩增实验中，我们需要检测其中的RNA，而不能检测出同源的DNA。如果这些同源的DNA难以去除干净，就可能会造成假阳性的结果。例如，血清中的HBVpgRNA代表当前肝组织中的HBVcccDNA是否活跃，如果研究人员扩增血清中的HBVpgRNA，RT-qPCR实验会将血清中的HBVDNA(HBVrcDNA)一并扩增，RNA和DNA共同扩增，不能正确反映肝组织中HBVcccDNA复制的活跃程度，影响后续实验的精准度。在临床检验方面，检测痰液活的结核杆菌，需要去除结核杆菌的DNA，检测对象是活菌中仅表达的mRNA。如果结核杆菌DNA被扩增，则无法判断痰液中的结核杆菌是否具有感染性。在现有技术中，获得不含DNA的RNA提取方法，主要依靠DNAse(主要是DNAseI)的消化作用。但是DNAse的活性并不稳定，通常并不能将DNA去除干净。而且DNAse价格昂贵，使用量大，很难广泛应用于病原体的检测。传统的Trizol法(酸酚法)通常被认为可去除DNA。Trizol法主要使用异硫氰酸胍和重蒸酚，异硫氰酸胍裂解细胞后，通过有机相萃取掉结合了大量组蛋白的基因组DNA，可以去除大部分基因组DNA。但此方法无法去除结合蛋白较少、分子量较小的DNA，如质粒DNA和病毒DNA。所以Trizol法并不适合前面两种应用。而且Trizol法需要使用苯酚、氯仿等有机试剂，严重危害了研究人员的身体健康。根据现有问题，本专利技术致力于寻求一种提取不含有DNA的RNA方法。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种方法，无须DNAseI，通过与含有抑制剂的植物成分共提取，回收不含DNA的RNA。为达到上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术第一个方面，提出了小桐子幼叶的应用，小桐子幼叶作为DNA抑制剂在RNA提取中的应用。根据本专利技术的实施例，所述小桐子幼叶生长10～30天的小桐子幼叶。根据本专利技术的实施例，所述RNA提取适用不含同源DNA的病毒RNA或杆菌RNA。根据本专利技术的实施例，所述肝炎病毒为乙型肝炎病毒；所述杆菌为结核杆菌。根据本专利技术的实施例，所述小桐子因结合样本DNA而减少DNA含量。根据本专利技术的实施例，所述RNA提取步骤如下：将小桐子幼叶和裂解液混合后，与样本混合；异丙醇磁吸、洗涤液磁吸和洗脱液磁吸，取上清即得不含DNA的RNA。本专利技术第二个方面，提出了前面所述小桐子幼叶的使用方法，包括以下步骤：①小桐子幼叶在液氮中迅速研磨成粉末；②将BufferS加到粉末，混合成裂解混合液，振荡使其裂解；③将裂解混合液孵育；④再加入BufferP冰上孵育；⑤将裂解混合液离心，取上清液；⑥将步骤⑤上清液与样本混合，使用常规方法进行RNA提取。根据本专利技术的实施例，步骤②所述BufferS由以下质量份成分组成：50mMTris，20～30mMEDTA，3～5％SDS。根据本专利技术的实施例，步骤②所述BufferS包括50mMTris、25mMEDTA和3％SDS。根据本专利技术的实施例，所述小桐子幼叶和BufferS的质量体积比为：50～100mg：400～500μL。根据本专利技术的实施例，步骤③所述孵育条件为：65～70℃孵育10～15分钟，倒置管混合2～3次。根据本专利技术的实施例，步骤④BufferP与步骤②BufferS体积比：400～500μL：130～162.5μL。根据本专利技术的实施例，步骤④所述BufferP为3M乙酸钾KOAc，pH5.5。根据本专利技术的实施例，步骤⑤20,000×g离心5～10分钟。根据本专利技术的实施例，步骤⑥所述样本选自HBV血清、肺灌洗液或NaOH处理过的结核杆菌痰液的任意一种；所述上清液与样本体积比为1：9～19。根据本专利技术的实施例，所述小桐子研磨液中的某种成分结合了混合液中的DNA，造成DNA无法被提取。专利技术人偶然发现，提取小桐子幼叶的核酸时，仅能够提取RNA，而无法提取DNA。将提取试剂的组成改变，加入5％的PVP40用于结合其中的抑制剂后，可以同时提取小桐子幼叶的DNA和RNA。专利技术人推测，小桐子幼叶存在某种可被PVP40结合的抑制剂，结合了DNA，使DNA无法回收，但这种抑制剂并不会结合RNA。因此，可以将这两者结合起来，反常规思维而行(核酸提取的纯度越高越好)，通过人为地引入小桐子进行共提取，获得不含同源DNA的RNA。本专利技术的有益效果是：本专利技术公开了一种利用抑制剂回收不含DNA的RNA的方法，本专利技术使用经处理的生长至一定周期的小桐子幼叶研磨上清液，与样本进行共提取，可以阻止样本中与病原体RNA同源的病原体DNA的回收，从而提高病原体RNA的提取质量。样本包括但不仅是病毒、细菌等。本专利技术的提取方法可以达到安全、经济、高效，不用增加时间长、成本高的DNAseI消化步骤，即可获得不含同源DNA的病原体RNA。附图说明图1为使用本专利技术方法扩增HBVpgRNA的扩增曲线图。图2为使用本专利技术方法扩增结核杆菌mRNA的扩增曲线图。图3为使用生长天数为30天的小桐子幼叶扩增结核杆菌mRNA的扩增曲线图。图4是使用生长天数为330天的小桐子叶片扩增图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。实施例1HBV样本购自广州邦德盛生物科技有限公司，经HBV试剂盒(购自：罗氏股份公司)检测，测得HBVDNA＞105IU/mL。小桐子幼叶：生长10天的小桐子幼叶小桐子幼叶处理方法：①50～100mg小桐子幼叶在液氮中迅速研磨成粉末；②加入500μLBufferS(50mMTris，25mMEDTA，3％SDS)，涡旋振荡使其充分裂解；③将混合液在65℃孵育10分钟。在培养期间通过倒置管混合2或3次；④向混合液中加入162.5μLBufferP(3MKOAc，pH5.5)，混合，在冰上孵育5分钟；⑤将混合液以20,000xg(14,000rpm)离心5分钟，吸取上清液100μL至新的离心管，待用。将20μL上清液与380μLHBV血清样本混合后按下面方法进行核酸提取。核酸提取试剂及其方法：裂解液：Tris-ClpH8，4M异硫氰酸胍，15％TritonX-100，100mMNaCl；洗涤液1：3M盐酸胍，65％乙醇；洗涤液2：75％乙醇；洗脱液：10mMTris-ClpH7.5，1mMEDTA；1)将400μL样本加入1200μL裂解液中，混匀后，1000rpm振荡5min；2)加入400μL异丙醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.小桐子幼叶作为DNA提取抑制剂在RNA提取中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.小桐子幼叶作为DNA提取抑制剂在RNA提取中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小桐子幼叶为生长10～30天的小桐子幼叶。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RNA提取适用不含同源DNA的病毒RNA或杆菌RNA。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝炎病毒为乙型肝炎病毒；所述杆菌为结核杆菌。


5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小桐子幼叶结合样本DNA而减少DNA含量。


6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述RNA提取包括以下步骤：将小桐子幼叶和裂解液混合后，与样本混合；异丙醇磁吸、洗涤液磁吸和洗脱液磁吸，取上清即得不含DNA的RNA。


7.权利要求1所述小桐子幼叶的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
①小...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓玮，李娇，陈凯婷，
申请(专利权)人：广州湾区生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44