【技术实现步骤摘要】
一种内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法
本申请属于细胞生物学
，具体涉及一种内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法。
技术介绍
细菌胞外囊泡（extracellularvesicles，EVs）是细菌在生长过程中自发产生的一种纳米尺寸的球形磷脂双分子层蛋白。EVs的尺寸一般在20~300nm之间，其中包含有脂多糖（LPS）、蛋白质、脂质、DNA、RNA、毒力因子等物质。由于细菌分为革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两大类，其中革兰氏阳性细菌是单独的细胞壁结构，其胞外囊泡被称为EVs；而革兰氏阴性细菌有两层膜，外膜跟内膜，而革兰氏阴性细菌的EVs起源于外膜，因此也叫作（outermembranevesicles，OMVs）。由于细菌胞外囊泡的形成过程的特殊性，部分应用研究研究表明，利用细菌纳米胞外囊泡载药时，表现出较好的：获取成本低、容易通过基因工程的技术进行改造、磷脂双分子层的结构十分稳定、可以通过发酵的技术大量获得、可以穿过多重生理屏障等优点，因此以细菌胞外囊泡（EVs）作为药物递送系...
【技术保护点】
1.一种内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：/n（一）设计引物及PCR扩增/n以Lys-tRNA的序列和pET-31b(+)载体序列为基础，设计PCR扩增用引物序列如下：/npET-31b(+)-F：/n5’- AACTCGAGCATATGAATTCATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATT-3’，/npET-31b(+)-R：5’- TTCTCGAGGATCC GCAATAACTAGCATAACCCCTTG-3’；/ntRNA-F：5’- TTGAATTCTGGCTGGGGTACCTGGATTCGAACCAG...
【技术特征摘要】
1.一种内源性高表达miRNA的大肠杆菌胞外囊泡的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（一）设计引物及PCR扩增
以Lys-tRNA的序列和pET-31b(+)载体序列为基础，设计PCR扩增用引物序列如下：
pET-31b(+)-F：
5’-AACTCGAGCATATGAATTCATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATT-3’，
pET-31b(+)-R：5’-TTCTCGAGGATCCGCAATAACTAGCATAACCCCTTG-3’；
tRNA-F：5’-TTGAATTCTGGCTGGGGTACCTGGATTCGAACCAG-3’，
tRNA-R：5’-AAGGATCCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTC-3’；
所述Lys-tRNA序列如SEQIDNO.1所示，具体为：
GAATTCGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGCGGCCGCGGCCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCAAAGCTT；
PCR扩增时，以大肠杆菌DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增完成后，提取备用；
（二）酶切、连接
利用EcoR1、BamH1限制性内切酶分别对步骤（一）中所回收PCR扩增产物进行双酶切，回收酶切片段进行连接；
（三）转化、筛选和鉴定
将步骤（二）中的连接产物转化DH5a感受态细胞，并进行抗性筛选、菌落PCR鉴定和测序鉴定；
（四）重组载体的自连
对步骤（三）中测序正确的质粒，采用XhoI限制性内切酶酶切，回收酶切片段后，进行连接，然后再将连接产物转化DH5a感受态细胞，并进行菌落PCR鉴定，并将鉴定正确的阳性克隆进行培养，此即为含有pET-31b(+)-tRNA载体的转化细菌，备用；
（五）针对目的miRNA，设计引物并进行PCR扩增
以人基因组DNA为模板，PCR扩增完成后，回收、纯化扩增产物；
（六）酶切、连接
利用XhoI、NdeI限制性内切酶，对步骤（四）中最终重新自连的pET-...
【专利技术属性】
技术研发人员：翁海波，崔晨阳，郭婷婷，张帅，程家琪，杨明研，王婉佳，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。