成纤维细胞生长因子21的制备、纯化及其结晶制造技术

本发明专利技术提出了一种构建体。该构建体包括：FGF21基因29‑209片段以及携带有纯化标签的表达载体，所述纯化标签的5’端与所述FGF21基因29‑209片段的3’端相连。该构建体导入宿主细胞后FGF21的表达量高、纯化简单，能将FGF21蛋白纯化到95％以上，且表达出的FGF21蛋白具有缓解胰岛素抵抗的活性。

Preparation, purification and crystallization of fibroblast growth factor 21

【技术实现步骤摘要】
成纤维细胞生长因子21的制备、纯化及其结晶
本专利技术涉及生物领域，具体地，本专利技术涉及成构建体、重组菌株及其制备方法、利用大肠杆菌制备FGF21蛋白的方法、制备FGF21蛋白晶体的方法、FGF21蛋白晶体、药物组合物及其药物联合。
技术介绍
FGF21是成纤维细胞生长因子家族成员之一，该家族成员的主要生理功能为细胞增殖、分化和代谢的调节。该家族有22个成员，它们的一级氨基酸序列具有一定的同源性，在生物学功能方面也有类似性，在促进胚胎发育、组织形成或修复、变异细胞生长、炎症或是血栓形成等过程中发挥着重要的作用。例如，其家族蛋白对于成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞都有着促增殖和分裂的作用。FGF家族蛋白发挥生物学效应需要通过和靶细胞的膜表面受体结合，该结合主要分为两种不同的形式，其中，通过硫酸肝素锚定与成纤维细胞生长因子受体(FGFR)结合从而调节细胞的分化与增殖是该家族成员最主要的经典作用途径。FGF家族蛋白可以划分为7个亚家族，其中成纤维细胞生长因子21(FGF21)与FGF19和FGF23同属一个亚家族，该亚家族成员发挥信号传导作用的方式与其他亚家族的经典途径不同，该三者都是通过辅助受体βKlotho的协助来激活细胞膜表面的FGFR，从而发挥作用来调节靶细胞的代谢。人FGF21氨基酸组成共有209个，N-端有由28个氨基酸组成的信号肽，相对分子质量为22.3kDa。与其他FGF家族成员一致，FGF21也有其特定的表达部位，其在肝脏、脂肪组织以及胰腺中均有表达，其中肝脏是其最主要的表达场所。至今为止，共发现的FGF受体有5种，均为酪氨酸激酶受体，其中FGF21能够刺激FGFR1，FGFR2以及FGFR4中的酪氨酸磷酸化。目前，国内外关于FGF21的制备主要仍是利用原核体系中包涵体复性的方法进行，即是利用原核表达得到蛋白，但大部分表达产物均存在于包涵体中，需要通过蛋白质变性复性等多个过程才能够得到目的蛋白。这种方式纯化的FGF21蛋白产率低，蛋白活性弱，并且存在异构体杂质。近来，也有研究者将蛋白进行修饰或利用真核表达系统来进行FGF21蛋白的制备，如王会岩等人将重组FGF21直接与小泛素相关修饰蛋白融合后，在大肠杆菌中进行表达来实现蛋白的可溶性表达，但该方法表达水平和活性相对较低；付宏岐等利用植物病毒载体，在烟草植物中表达分离纯化出FGF21蛋白，但非融合的FGF21基因未能在烟草植物种瞬时高水平表达，并且真核表达系统的成本较于原核表达系统更高。除此之外，也有研究者利用融合表达技术，将FGF21与分子伴侣进行共表达，但该方法所制备得到的FGF21在N-端具有不均一性，会影响其发挥生物活性。因而，FGF21的制备、提纯、结晶仍有待开发和改进。
技术实现思路
现有技术中关于FGF21的制备主要仍是利用原核体系中包涵体复性的方法进行，即利用原核表达得到蛋白，但大部分表达产物均存在于包涵体中，需要通过蛋白质变性复性等多个过程才能够得到目的蛋白。这种方式纯化的FGF21蛋白产率低，蛋白活性弱，并且存在异构体杂质。另外，现有技术中还没有关于FGF21结晶技术和晶体的研究，专利技术人发现，现有技术的FGF19和FGF23结晶的条件并不适宜获得FGF21晶体。基于上述事实和问题的认识和发现，专利技术人提出了一种新的利用原核体系表达FGF21基因的方法，该方法通过引入纯化标签，构建出了原核系统(如大肠杆菌)可溶性高水平表达FGF21的方法，克服了包涵体复性制备蛋白的缺点，同时利用多种纯化方式得到了纯度在95％以上的FGF21蛋白，并通过实验证实了，通过该方法表达获得的FGF21具有缓解胰岛素抵抗的活性，并且专利技术人还首次提出了FGF21的结晶条件，首次得到了FGF21蛋白结晶，为解析FGF21空间构型以及阐明FGF21发挥生物活性的机制奠定基础，同时也为FGF21作为药用物质奠定基础。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种构建体。根据本专利技术的实施例，所述构建体包括：FGF21基因29-209片段以及携带有纯化标签的表达载体，所述纯化标签的5’端与所述FGF21基因29-209片段的3’端相连。本领域技术人员所公知的是，目标蛋白与纯化标签蛋白构成的融合蛋白的表达量会相对于目标蛋白的表达量有所提升，但专利技术人在实验中却意外地发现，对于制备可溶性的目的蛋白FGF21，选择29-138，29-149以及29-209三个蛋白片段，分别与纯化标签(His标签或GST标签)融合后，发现只有29-209蛋白片段与纯化标签融合后获得的融合蛋白的表达量提高了，而29-138，29-149蛋白片段与纯化标签的融合蛋白的表达量依然很低。因而，根据本专利技术实施例的构建体是专利技术人在实验中意外发现地能够显著高表达FGF21的构建体，将根据本专利技术实施例的构建体导入宿主细胞后FGF21的表达量高、纯化简单，能将FGF21蛋白纯化到95％以上，且表达出的FGF21蛋白具有缓解胰岛素抵抗的活性。根据本专利技术的实施例，上述构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述表达载体为原核细胞表达载体。根据本专利技术的实施例，所述原核表达载体为pET-28a-TEV以及pGEX-4T-2。其中，pET-28a-TEV是由pET-28a改造获得，携带His标签，pGEX-4T-2携带GST标签。由此，可在融合蛋白中引入纯化标签。根据本专利技术的实施例，所述FGF21基因29-209片段具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。cacccgattccggattcctctcagtcctctcctgcaattcgggggccaagtccggcagcggtacctctacacagatgatgcccagcagacagaagcccacctggagatcagggaggatgggacggtggggggcgctgctgaccagagccccgaaagtctcctgcagctgaaagccttgaagccgggagttattcaaatcttgggagtcaagacatccaggttcctgtgccagcggccagatggggccctgtatggatcgctccactttgaccctgaggcctgcagcttccgggagctgcttcttgaggacggatacaatgtttaccagtccgaagcccacggcctcccgctgcacctgccagggaacaagtccccacaccgggaccctgcaccccgaggaccagctcgcttcctgccactaccaggcctgccccccgcactcccggagccacccggaatcctggccccccagccccccgatgtgggctcctcggaccctctgagcatggtgggaccttcccagggccgaagccccagctacgcttcctga(SEQIDNO:1)。根据本专利技术的实施例，所述纯化标签包括选自His和GST的至少之一。专利技术人发现，His和GST的至少之一的标签的引入，能够通过增加融合蛋白的水溶性而避免原核表达系统中包涵体的出现，进而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建体，其特征在于，包括：FGF21基因29-209片段以及携带有纯化标签的表达载体，所述纯化标签的5’端与所述FGF21基因29-209片段的3’端相连。/n

【技术特征摘要】
1.一种构建体，其特征在于，包括：FGF21基因29-209片段以及携带有纯化标签的表达载体，所述纯化标签的5’端与所述FGF21基因29-209片段的3’端相连。


2.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述表达载体为原核细胞表达载体；
任选地，所述原核表达载体为pET-28a-TEV以及pGEX-4T-2；
任选地，所述FGF21基因29-209片段具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；
任选地，所述纯化标标签包括选自His和GST的至少之一；
任选地，所述构建体具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。


3.一种重组菌株，其特征在于，其含有权利要求1～2任一项所述的构建体；
任选地，所述重组菌株为大肠杆菌。


4.一种制备权利要求3所述的重组菌株的方法，其特征在于，将权利要求1～2任一项所述的构建体引入宿主细胞中；
任选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。


5.一种利用大肠杆菌制备FGF21蛋白的方法，其特征在于，包括：
在适于FGF21蛋白表达的条件下，培养权利要求3的所述重组菌株或依据权利要求4所述的方法获得的重组菌株，以便获得所述FGF21蛋白；
任选地，所述方法进一步包括对所述FGF21蛋白进行第一纯化处理；
任选地，所述第一纯化处理是通过亲和层析、切除标签、离子交换层析以及凝胶过滤层析的至少之一进行的；
任选地，所述方法进一步包括对纯化处理产物进行酶切处理，以便去除纯化标签；
任选地，所述酶切处理是在TEV酶消化下进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：任发政，刘静文，张昊，郭慧媛，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11