一种生物脱硫菌改造用质粒构建中制取载体的方法技术

本发明专利技术提供一种可用于生物脱硫菌改造用质粒构建中制取载体的方法。所述方法是利用一种分离自嗜盐嗜碱极端脱硫微生物的特定的酶TmUvr，在目的位点将质粒切成线性片段，然后这个线性的载体进一步连入目的片段，从而完成质粒的构建。本发明专利技术避免了在构建质粒过程中遇到的没有合适酶切位点的情况下，需要经过反向PCR扩增得到载体而引入的复杂操作以及带入的碱基突变问题。从而提高了实验效率和实验的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种生物脱硫菌改造用质粒构建中制取载体的方法
本专利技术涉及到分子生物学中质粒构建的载体制取的方法。具体为一种可用于生物脱硫菌改造用质粒构建中制取载体的方法。
技术介绍
在分子生物学领域，基因编辑以及超表达等遗传操作往往需要通过构建相关的质粒来实现。而质粒构建一般有两种常用的方式：①将载体目的部分通过反向PCR扩增，然后于插入片段连接；②将载体酶切，然后将片段插入酶切位点。当酶切位点比较丰富时，质粒构建显得简单快捷。然而当没有合适酶切位点时，传统的方法往往需要通过反向PCR进行扩增，那么这就会出现以下的几个问题：一是当质粒足够的大的时候，反向扩增会比较困难，需要选择高效的扩增酶得以实现。扩增过程不但耗费材料和时间，对于长片段扩增很多时候不能得到理想的目的条带，需要多次的摸索条件，从而又增加了科研人员的工作量；二是扩增过程的中经常会导致某些碱基的突变或缺失，这就增加了实验的不可以预知性。这两种方法都会受到由于原有载体的存在而造成假阳性的问题。目前，仍然没有有效的方法来克服这些问题。所以，解决这些问题对于分子生物学实验有着非常的大的意义和价值。...

【技术保护点】
1.一种生物脱硫菌改造用质粒构建中制取载体的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤:/n（1）构建PET-tmu表达载体，并在

【技术特征摘要】
1.一种生物脱硫菌改造用质粒构建中制取载体的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤:
（1）构建PET-tmu表达载体，并在E.coliBL21中表达TmUvr酶，进行分离纯化，制备成TmUvr酶液；
（2）选择一个质粒作为研究对象；
（3）在质粒任意位置选择15-50bp的序列，合成5’磷酸化的正反向引物FssDNA和RssDNA；
（4）取上述步骤2的质粒，加入上述步骤1的TmUvr酶、上述步骤3的FssDNA和RssDNA，每50μl反应体系加入TmUvr酶1μl以上，加入引导序列各1μl以上，在20℃以上，孵育反应的时间为1小时以上，然后通过凝胶电泳检验酶切效果；
（5）取0.1-5μg酶切后的的产物，按比例加入1-5μLTmUvr酶、1-5μLFssDNA和1-5μLRssDNA，在37℃下孵育0.5-1.0小时，然后取1-10μL加入T4连接酶5μL组成μL连接体系在4℃下过夜连接；并取1-5μL连接产物与DH5α感受态混合转化，通过PCR验证并筛选阳性克隆。


2.如权利要求1所述的一种生物脱硫菌改造用质粒构建中制取载体的方法，其特征在于：表达TmUvr酶的基因来自于Thioalkalimicrobium，并包括与Tm...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐斌，邢建民，穆廷桢，
申请(专利权)人：雅邦绿色过程与新材料研究院南京有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32