特异性存在于调节性T细胞中的DKK1蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术涉及Dickkopf‑1(DKK1)蛋白、其特异性抗体及其用途，DDK1蛋白特异性存在于免疫细胞，特别是调节性T细胞(Treg细胞)的表面上。在本发明专利技术中，由于DKK1蛋白特异性存在于免疫细胞，特别是调节性T细胞的表面，DKK1蛋白可用作各种免疫相关疾病治疗剂的新靶标。

DKK1 protein in regulatory T cells and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】特异性存在于调节性T细胞中的DKK1蛋白及其用途
本专利技术涉及Dickkopf-1(DKK1)蛋白、其特异性抗体及其用途，DDK1蛋白特异性存在于免疫细胞，特别是调节性T细胞(Treg细胞)的表面上。
技术介绍
免疫细胞中，T细胞是在骨髓中产生并在胸腺中成熟的免疫细胞，其功能是调节B细胞的抗体产生或调节天然免疫细胞的功能。T细胞，也称为T淋巴细胞，不仅可以充当其他免疫细胞的助手，还可以直接消灭入侵物。在免疫细胞的功能中，最重要的是这些免疫细胞对构成自身的抗原物质和免疫细胞周围的抗原物质显示出抑制的免疫应答，同时识别非自身抗原物质并诱导对其的免疫应答。在发育过程中，通过杀伤识别自身的细胞、在自身抗原的特异性受体中诱导突变或失活识别自身抗原的免疫细胞，免疫细胞不会对自身抗原产生应答，这称为免疫无反应性或免疫耐受。这种自我耐受的失效会诱导对自身抗原的免疫应答，从而导致疾病。这种疾病称为自身免疫疾病。在19世纪70年代初期，为了诱导或维持自身耐受性，引入了调节性T细胞的概念，其可以控制常规T细胞的效应功能(RKGershon和K.Kondo，免疫学，1970，18：723-37)。自此，阐明抑制性T细胞的免疫学性质和功能的研究一直在进行。在正常个体中，调节性T细胞控制常规T细胞的功能，诱导过度的免疫应答或自我耐受。但是，据报道，在自身免疫性和慢性炎症性疾病中，调节性T细胞的功能和数量显著降低，调节性T细胞因而不能发挥正常功能。因此，在患有自身免疫性和慢性炎症性疾病的患者中，使调节性T细胞的功能和数量恢复正常水平可能是该疾病的治疗方法之一。已经有人通过研究提出CD25、CTLA4、CD38、CD62L、GITR、CD45RB等作为靶向调节性T细胞的细胞表面蛋白，并已经进行了动物和临床试验。然而，迄今为止尚未发现只靶向调节性T细胞的细胞表面蛋白。技术问题本专利技术的目的是提供特异性存在于调节性T细胞表面的Dickkopf-1(DKK1)蛋白或其表位。本专利技术的又一个目的是提供特异性存在于调节性T细胞表面的DKK1蛋白的特异性抗体。本专利技术的又一个目的是提供在其细胞表面表达有DKK1蛋白的调节性T细胞。本专利技术的又一个目的是提供一种筛选免疫抑制剂或免疫活化剂的方法。本专利技术的又一个目的是提供一种预防或治疗免疫相关疾病的方法。本专利技术的又一个目的是提供一种诊断免疫相关疾病的方法。然而，本专利技术要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员可从以下描述中清楚地理解未提及的其他问题。解决问题的技术方案本专利技术人发现了特异性存在于免疫细胞，特别是调节性T细胞表面的Dickkopf-1(DKK1)蛋白，并筛选了该蛋白的表位。另外，本专利技术人发现，在选择性地筛选表达DKK1蛋白的免疫细胞(特别是调节性T细胞)并与效应T细胞共孵育的情况下，效应T细胞的活性会被抑制，从而完成了本专利技术。在本专利技术中，DKK1是DKK家族基因DKK1、DKK2、DKK3、DKK4之一，编码分泌的蛋白。DKK蛋白通常由255至350个氨基酸组成。DKK1的大小为24KDa至29KDa，其N端以糖基化形式存在。作为本专利技术的一个实例，DKK1的氨基酸序列可以如SEQIDNO：1所示，并且可以由SEQIDNO：2所示的核苷酸编码。[表1]在本专利技术中，与诸如Wnt3a的配体相比，DKK1强烈结合涉及细胞增殖和伤口恢复的Wnt信号传导系统中的受体，从而竞争性地抑制Wnt信号。因此，DKK1可在胚胎发育过程中，如在心脏、头、手等的发育中发挥重要作用。此外，通过以分泌蛋白形式存在于骨髓血浆中的DKK1水平的增加，DKK1可用于鉴定多发性骨髓瘤患者的溶骨性骨病变，并可以用于确定DKK1癌症或骨病的等级。然而，在本专利技术中，DKK1可以存在于免疫细胞，特别是调节性T细胞的表面，而不像通常情况那样从细胞中分泌出来。这可以使免疫细胞在调节性T细胞的自身耐受中发挥作用。根据本专利技术的一种实施方式，提供了SEQIDNO：3所示的DKK1的调节性T细胞外表面蛋白(表2)。[表2]本专利技术提供了DKK1的调节性T细胞外表面蛋白，其可与效应T细胞上存在的配体相互作用以降低调节性T细胞的活性。根据本专利技术的另一种实施方式，提供了DKK1的表位，其是调节性T细胞表面蛋白，如SEQIDNO：4-36中任一所示(表3)。[表3]如本文所用，术语“表位”是指与抗体结合并且可以被抗体识别的抗原分子的一部分。通常，抗体不识别整个抗原分子，而仅识别其特定部分。即使是相同的抗原分子，也可根据抗体的种类识别不同的表位区域。用于本专利技术目的的表位包括这样的表位，即使DKK1蛋白暴露于细胞外的部分被局部切割并分泌到细胞外，剩余的部分区域也可以与抗体有效结合。在本专利技术中，作为表位的多肽可以包括可与抗体结合的根据本专利技术的DKK1蛋白一部分的连续和不连续序列。另外，本专利技术提供了一种作为调节性T细胞表面蛋白DKK1的表位的多肽片段，其可以与效应T细胞中存在的配体相互作用从而降低调节性T细胞的活性。根据本专利技术的另一种实施方式，提供了一种多核苷酸，该多核苷酸编码如SEQIDNO:3所示的DKK1的胞外表面蛋白，或编码本专利技术提供的SEQIDNO:4-36中任一所示的DKK1表位。根据本专利技术的另一种实施方式，提供了一种插入有本专利技术提供的多核苷酸的表达载体。在本专利技术中，“载体”是能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，质粒是指可以接入其他DNA区段的环状双链DNA。另一类载体是噬菌体载体。还有一类载体是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接到所述病毒的基因组中。某些载体能够在导进的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体(episomalmammalianvector))。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。通常,可用于重组DNA技术的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。本专利技术中表达载体的具体实例可以选自但不限于下组：商业上广泛使用的pCDNA载体、F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；粘粒；噬菌体，如λ噬菌体、人字形噬菌体、M13、Mu、p1P22、Qμ、T-even、T2、T3、T7噬菌体；植物病毒。作为表达载体，本领域技术人员已知的任何表达载体，均可用于本专利技术，并根据靶宿主细胞的性质选择表达载体。可通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、或电穿孔将载体导入宿主细胞。然而，本专利技术不限于此，本领域技术人员可以采取和使用适合于所用表达载体和宿主细胞的导入方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选免疫激活剂或免疫抑制剂的方法，包括以下步骤：/n(a)使待测样品与含有Dickkopf-1(DKK1)胞外表面蛋白或表位的调节性T细胞接触，所述表位如SEQ ID NO：4-36中任一所示；/n(b)检测所述胞外表面蛋白或表位的表达水平；和/n(c)在所述胞外表面蛋白或表位的表达水平检测为下调或上调的情况下，判定所述样品是免疫激活剂或免疫抑制剂。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170510 KR 10-2017-0058336;20170510 KR 10-2017-001.一种筛选免疫激活剂或免疫抑制剂的方法，包括以下步骤：
(a)使待测样品与含有Dickkopf-1(DKK1)胞外表面蛋白或表位的调节性T细胞接触，所述表位如SEQIDNO：4-36中任一所示；
(b)检测所述胞外表面蛋白或表位的表达水平；和
(c)在所述胞外表面蛋白或表位的表达水平检测为下调或上调的情况下，判定所述样品是免疫激活剂或免疫抑制剂。


2.如权利要求1所述的方法，
其中，所述胞外表面蛋白或表位的表达水平利用能够特异性结合所述胞外表面蛋白或表位的抗体进行检测。


3.如权利要求1所述的方法，
其中，所述的DKK1胞外表面蛋白如SEQIDNO：3所示。


4.如权利要求1所述的方法，
其中，所述胞外表面蛋白或表位的表达水平利用选自下组的方法进行检测：蛋白芯片分析、免疫测定、配体结合测定、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF)测定、放射免疫测定、放射免疫扩散、欧氏免疫扩散(Ouchterlonyimmunodiffusion)、火箭免疫电泳(rocketimmunoelectrophoresis)、组织免疫染色、补体固定测定、二维电泳测定、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、液相二级质谱(LC-MS/Ms)、免疫印迹、和酶联免疫吸附测定(ELISA)。


5.一种筛选免疫激活剂或免疫抑制剂的方法，包括以下步骤：
(a)使待测样品与含有Dickkopf-1(DKK1)胞外表面蛋白或表位的编码基因的调节性T细胞接触，所述表位如SEQIDNO：4-36中任一所示；
(b)检测所述基因的表达水平；和
(c)在所述基因的表达水平检测为下调或上调的情况下，判定所述样品是免疫激活剂或免疫抑制剂。


6.如权利要求5所述的方法，
其中，利用能够与所述基因特异性结合的引物、探针或反义核苷酸检测所述基因的表达水平。


7.如权利要求5所述的方法，
其中，所述的DKK1胞外表面蛋白如SEQIDNO：3所示。


8.如权利要求5所述的方法，
其中，所述基因的表达水平利用选自下组的方法进行检测：逆转录聚合酶反应、竞争性逆转录聚合酶反应、实时逆转录聚合酶反应、RNA酶保护测定、Northern印迹和DNA芯片法。


9.一种如SEQIDNO：4-36中任一所示的Dickkopf-1(DKK1)表位。


10.一种用于预防或治疗免疫相关疾病的药物组合物，包含
调节性T细胞(Treg细胞)作为活性成分,所述的调节性T细胞含有SEQIDNO：3所示的Dickkopf-1(DKK1)胞外表面蛋白。


11.如权利要求10所述的药物组合物，
其中，所述的免疫相关疾病选自下组：自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、哮喘、特应性疾病和急性或慢性炎症性疾病。

【专利技术属性】
技术研发人员：金廷镐，金范锡，
申请(专利权)人：古德T细胞有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR