扩增造血干细胞的组合物、扩增方法、药物组合物和用途技术

本发明专利技术提出了扩增造血干细胞的组合物、扩增方法、药物组合物和用途，所述组合物由JNK‑IN‑8、雷帕霉素和Y27632组成。利用本发明专利技术的组合物可以高效扩增造血干细胞，有效维持造血干细胞的蛋白表型和基因表达谱，而且能够提高造血干细胞的体内重建功能和重建效率，具有重大的科学研究、临床研究和应用价值。

Composition, amplification method, pharmaceutical composition and application of expanded hematopoietic stem cells

【技术实现步骤摘要】
扩增造血干细胞的组合物、扩增方法、药物组合物和用途
本专利技术涉及生物医药领域。具体地，本专利技术涉及组合物在扩增造血干细胞中的用途。
技术介绍
造血干细胞移植技术是临床上治疗白血病、淋巴瘤、再生障碍性贫血、地中海贫血等多种血液类疾病和免疫系统疾病的常用且有效治疗手段。造血干细胞通常有三个来源：骨髓、外周血和脐带血。与骨髓和外周血造血干细胞相比，脐带血造血干细胞获取方便、来源丰富、对供者无损伤无副作用，因此成为造血干细胞移植供体的一大重要来源。目前，脐带血造血干细胞移植技术的瓶颈在于其细胞含量少，一份脐带血中所含的造血干细胞及祖细胞数量不足以快速恢复成人患者的免疫系统，造成机会性感染致死率的增高。目前暂行的策略是双份脐带血移植，即一位患者清髓后先后接受两份脐带血的移植，但这增加了供体的HLA配型匹配难度，因此，亟需扩增脐带血造血干细胞的方法，以获得足量的可供移植的造血干细胞。因此，如何在体外有效获得足量的造血干细胞成为了一大科学难题，未来若能突破这个技术瓶颈，将会书写干细胞临床应用的新篇章。当前，限制造血干细胞临床应用的最重要的因素是HSC数量不足。解决这个难题大致有三种策略：（1）通过iPSC或ESC直接分化获得具有功能的HSCs；（2）通过细胞重编程获得HSCs；（3）体外扩增已有的HSCs。由于前面两种方法涉及到的技术难度过大，而且对临床应用造成额外的风险，导致迟迟无法进行临床研究。体外扩增造血干细胞成为了解决这一难题的重要方法。体外扩增造血干细胞具有诸多优势，主要归纳为以下三个特点：（1）扩增的细胞同质性高，癌变风险低；（2）扩增HSC的操作时间相对较短，避免引入更多外源不利因素；（3）起始细胞是造血干/祖细胞，一般不存在致瘤风险，临床应用更加安全。扩增HSCs的研究总结起来大致可以分为两类：（1）利用基因操作手段，比如引入外源转录因子或微小RNA，扩增HSCs；（2）采用化学小分子扩增HSCs。近些年，随着化学小分子技术的不断进步，小分子化合物已经广泛应用于干细胞研究领域。利用小分子药物扩增HSCs具有很多明显的优势：低毒性、易洗脱、临床使用更加安全。但是也存在明显的不足，其中最令人担忧的就是小分子化合物作用靶点不够明确，可能会存在安全隐患，例如小分子的脱靶效应，因此临床上仍然缺乏安全有效且靶点明确的扩增造血干细胞的化学小分子组合方案。综上，目前利用化学小分子化合物组合以体外扩增造血干细胞的技术方案仍有待研究。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本专利技术通过高通量筛选平台，找到一些化学小分子化合物组合，其不仅可以使造血干细胞在体外高效扩增，有效维持造血干细胞的蛋白表型和基因表达谱，而且能够提高造血干细胞的体内重建功能和重建效率，具有重大的科学研究、临床研究和应用价值。在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种用于扩增造血干细胞的组合物。根据本专利技术的实施例，所述组合物由JNK-IN-8、雷帕霉素和Y27632组成。JNK-IN-8为JNK信号通路抑制剂，通过抑制c-Jun磷酸化和基因转录来实现调控JNK信号通路的作用；雷帕霉素（Rapamycin）为mTOR信号通路抑制剂，可用于抗衰老和抑制肿瘤生长；Y27632为ROCK1抑制剂，可用于抗衰老，对维持干细胞的活力有明显提升作用。专利技术人采用高通量筛选以便获得高效扩增造血干细胞的化合物，发现JNK-IN-8、雷帕霉素和Y27632这3个小分子化合物之间具有相互配合、增效的作用，可以高效扩增造血干细胞，有效维持造血干细胞的蛋白表型和基因表达谱，而且能够提高造血干细胞的体内重建功能和重建效率，具有重大的科学研究、临床研究和应用价值。在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种用于扩增造血干细胞的培养基。根据本专利技术的实施例，所述培养基包括：基础培养基；以及前面所述的用于扩增造血干细胞的组合物。由此，利用根据本专利技术实施例的培养基可以高效扩增造血干细胞，有效维持造血干细胞的蛋白表型和基因表达谱，提高造血干细胞的体内重建功能和重建效率，具有重大的科学研究、临床研究和应用价值。根据本专利技术的实施例，上述培养基还可以具有下列附加技术特征：根据本专利技术的实施例，所述JNK-IN-8的浓度为1~5μM，所述雷帕霉素的浓度为1~20nM，所述Y27632的浓度为1~20μM。根据本专利技术的具体实施例，JNK-IN-8、雷帕霉素和Y27632的浓度分别为2μM、10nM、10μM或3.5μM、15nM、7μM或1.5μM、8nM、15μM。根据本专利技术的具体实施例，所述JNK-IN-8的浓度为1~3μM，所述雷帕霉素的浓度为6~15nM，所述Y27632的浓度为5~15μM。专利技术人经过大量实验获得上述较优浓度，由此，均可以进一步提高扩增效率。根据本专利技术的实施例，所述基础培养基选自含有Flt3配体、血小板生成素（TPO）、干细胞生长因子（SCF）以及低密度脂蛋白（LDL）的StemSpanSFEM培养基。由此，向StemSpanSFEM培养基中加入上述因子，可以进一步提高扩增效率。根据本专利技术的实施例，所述Flt3配体的浓度为60~100ng/mL，所述血小板生成素的浓度为20~50ng/mL，所述干细胞因子的浓度为60~100ng/mL，所述低密度脂蛋白的浓度为5~20μg/mL。根据本专利技术的具体实施例，Flt3配体、血小板生成素、干细胞因子和低密度脂蛋白的浓度分别为100ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、10μg/ml或者80ng/ml、30ng/ml、80ng/ml、15μg/ml或者90ng/ml、40ng/ml、90ng/ml、6μg/ml。根据本专利技术的具体实施例，所述Flt3配体的浓度为80~100ng/mL，所述血小板生成素的浓度为40~50ng/mL，所述干细胞因子的浓度为80~100ng/mL，所述低密度脂蛋白的浓度为5~15μg/mL。专利技术人经过大量实验优化各组分的浓度，由此，均可以进一步提高扩增效率。根据本专利技术的实施例，本专利技术提出了JNK-IN-8、雷帕霉素和Y27632在制备组合物或培养基中的用途，所述组合物或培养基用于扩增造血干细胞。在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种扩增造血干细胞的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：采用前面所述的组合物抑制造血干细胞的下列代谢通路：JNK信号通路、mTOR信号通路和ROCK信号通路。专利技术人分别对能够抑制JNK信号通路、mTOR信号通路和ROCK信号通路的众多小分子物质进行高通量筛选分析，发现JNK-IN-8（JNK信号通路抑制剂）、雷帕霉素（mTOR信号通路抑制剂）和Y27632（ROCK信号通路抑制剂）3因子联合使用可以高效扩增造血干细胞，有效维持造血干细胞的蛋白表型和基因表达谱，而且能够提高造血干细胞的体内重建功能和重建效率，操作简便，具有广泛的应用前景。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将CD34＋细胞培养于前面所述用于扩增造血干细胞的培养基中。由此本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于扩增造血干细胞的组合物，其特征在于，由JNK-IN-8、雷帕霉素和Y27632组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增造血干细胞的组合物，其特征在于，由JNK-IN-8、雷帕霉素和Y27632组成。


2.一种用于扩增造血干细胞的培养基，其特征在于，包括：
基础培养基；以及
权利要求1所述的组合物。


3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述JNK-IN-8的浓度为1~5μM，所述雷帕霉素的浓度为1~20nM，所述Y27632的浓度为1~20μM；
所述基础培养基选自含有Flt3配体、血小板生成素、干细胞生长因子以及低密度脂蛋白的StemSpanSFEM培养基；
所述Flt3配体的浓度为60~100ng/mL，所述血小板生成素的浓度为20~50ng/mL，所述干细胞因子的浓度为60~100ng/mL，所述低密度脂蛋白的浓度为5~20μg/mL。


4.一种扩增造血干细胞的方法，其特征在于，包括：采用权利要求1所述的组合物抑制造血干细胞的下列代谢通路：JNK信号通路、mTOR信号通路和ROCK信号通路。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将CD34＋细胞培养于权利要求2或3所述的培养基中；
所述CD34＋细胞来源于骨髓、肝脏、脾脏、外周血...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙忠杰，肖雄，刘英全，刘德芳，齐海龙，郭潇，王晓芳，陈立功，
申请(专利权)人：诺未科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11