基于毛细管电泳法定量检测FLT3-ITD基因突变的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，且公开了基于毛细管电泳法定量检测FLT3‑ITD基因突变的方法，包括如下步骤：一、材料及试剂的准备，购入实验操作中所需的DNA提取试剂盒、PCR MIX、引物生工合成和甲酰胺；二、检测样本的处理，准备:1‑2ml外周血或骨髓血、DNA/RNA(OD260/280值1.8‑2.0)的血样标本，按照试剂盒中提取DNA的步骤进行相关实验操作。该基于毛细管电泳法定量检测FLT3‑ITD基因突变的方法，具备只需设计一对带有荧光标记的引物即可解决个体差异性问题，且操作简单，便于人们对FLT3‑ITD基因突变的的检测，可用于对具有FLT3‑ITD基因突变的白血病患者的诊断及追踪预后疗效，同时监测MRD的动态变化的优点。

Quantitative detection of flt3-itd gene mutation based on capillary electrophoresis

The invention relates to the field of molecular biology technology, and discloses a method for quantitative detection of FLT3 \u2011 ITD gene mutation based on capillary electrophoresis, including the following steps: 1. Preparation of materials and reagents, purchase of DNA extraction kit, PCR mix, primer production synthesis and formamide required in experimental operation; 2. Processing of test samples, preparation: 1 \u2011 2ml peripheral blood or bone marrow blood, DNA / RN A (od260 / 280 value 1.8 \u2011 2.0) blood sample, follow the steps of DNA extraction in the kit for relevant experimental operations. This method is based on capillary electrophoresis to detect FLT3 \u2011 ITD gene mutation. It can solve the problem of individual difference by designing a pair of primers with fluorescent markers, and it is easy to operate. It is convenient for people to detect FLT3 \u2011 ITD gene mutation. It can be used to diagnose and track the prognosis of leukemia patients with FLT3 \u2011 ITD gene mutation, and monitor the dynamic change of MRD The advantages of localization.

【技术实现步骤摘要】
基于毛细管电泳法定量检测FLT3-ITD基因突变的方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体为基于毛细管电泳法定量检测FLT3-ITD基因突变的方法。
技术介绍
FLT3基因位于染色体13q12，编码一种调节造血作用的III型受体酪氨酸激酶，血液和骨髓中仅限制性地表达于CD34+细胞。FLT3蛋白包括5个膜外IG样结构域、1个穿膜区和1个胞内激酶结构域，后者又被一个激酶插入区分为两部分。FLT3蛋白与膜外配体结合后，其胞浆内的激酶区形成同源二聚体，导致自身磷酸化。活化的FLT3蛋白可使多种胞浆的效应分子活化和磷酸化，参与骨髓造血细胞的凋亡、增殖和分化。FLT3过表达或突变常见于急性髓性白血病(AML)，在急性淋巴细胞白血病(ALL)中也可见。FLT3突变又可分内部串联重复突变(ITD)和酪氨酸激酶结构域(TKD)突变，两种突变对功能的影响、预后及治疗方面的意义均有不同。FLT3-ITD突变，即近膜区的序列重复突变，导致FLT3蛋白非受体依赖性的形成同源二聚体和活化。FLT3-ITD突变见于约20％的AML，是强烈的预后指标。FLT3-ITD突变的患者化疗不易缓解，而且即使得到缓解后也易复发。FLT3-ITD突变均为框内突变，插入的碱基长度平均为39-54bp，插入的序列越长预后越差。FLT3双等位基因突变的患者预后更差。突变比例越高的患者预后也越差。APL(M3)患者中FLT3-ITD突变率约40％。虽然APL总体治疗效果好，但伴FLT3突变的患者更易复发，更积极的治疗或联用FLT3-ITD靶向治疗药可能有助于提高疗效。FLT3突变在疾病发生过程中可能会发生变化，约10％的FLT3-ITD突变患者复发时FLT3突变转阴性或突变的序列发生改变；也有患者初诊时无FLT3突变，复发时才检测到FLT3突变；有的患者可能初诊时携带有较低水平的FLT3突变，复发时FLT3突变的克隆才转变为主要的克隆，从而被检测到。FLT3-ITD突变的患者采用靶向治疗药物索拉非尼(sorafenib，多美吉)、舒尼替尼(sunitinib，索坦)、来他替尼(Lestaurtinib)、帕纳替尼(Ponatinib)等TKIs有效，联合用药有可能提高治疗效果。但患者也可因继发性耐药突变的出现而耐药。Crenolanib对Sorafenib耐药FLT3-ITD突变有效。目前对于白血病患者FLT3-ITD基因突变的检测时需要根据FLT3-ITD基因插入不同片段的长度专门针对个体设计引物和探针的荧光定量，整个操作十分的繁琐不便，不便于人们对FLT3-ITD基因突变的的检测。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了基于毛细管电泳法定量检测FLT3-ITD基因突变的方法，具备只需设计一对带有荧光标记的引物即可解决个体差异性问题，且操作简单，便于人们对FLT3-ITD基因突变的的检测，可用于对具有FLT3-ITD基因突变的白血病患者的诊断及追踪预后疗效，同时监测MRD的动态变化的优点，解决了目前对于白血病患者FLT3-ITD基因突变的检测时需要根据FLT3-ITD基因插入不同片段的长度专门针对个体设计引物和探针的荧光定量，整个操作十分的繁琐不便，不便于人们对FLT3-ITD基因突变的的检测的问题。(二)技术方案为实现只需设计一对带有荧光标记的引物即可解决个体差异性问题，且操作简单，便于人们对FLT3-ITD基因突变的的检测，可用于对具有FLT3-ITD基因突变的白血病患者的诊断及追踪预后疗效，同时监测MRD的动态变化的目的，本专利技术提供如下技术方案：基于毛细管电泳法定量检测FLT3-ITD基因突变的方法，包括如下步骤：一、材料及试剂的准备购入实验操作中所需的DNA提取试剂盒、PCRMIX、引物生工合成和甲酰胺；二、检测样本的处理准备:1-2ml外周血或骨髓血、DNA/RNA(OD260/280值1.8-2.0)的血样标本，按照试剂盒中提取DNA的步骤进行相关实验操作，具体步骤如下：a、使用前在CB3和WB3中加入不同体积的无水乙醇并进行离心操作；b、准备2ml的离心管，在离心管中加入250μl待提取的全血；c、在步骤b的基础上加入20ul的蛋白酶K和500ulBB3于样本中，并在充分涡旋混匀后进行室温孵育；d、在步骤c的基础上将全部的混合溶液加入离心柱中进行充分离心，离心操作完成后弃流出液；e、在步骤d的基础上加入500ulCB3溶液(使用前请先检测是否加入无水乙醇)再次进行充分离心，离心操作完成后弃流出液；f、在步骤e的基础上加入500ulWB3溶液(使用前请先检测是否加入无水乙醇)再次进行充分离心，离心操作完成后弃流出液；g、在步骤f的基础上再次加入500ulCB3溶液(使用前请先检测是否加入无水乙醇)再次进行充分离心，离心操作完成后弃流出液；h、在步骤g的基础上再次进行充分离心操作，彻底去除残留的WB3；i、将离心柱置于一干净的离心管中，在柱子中央加入50-200ul预热EB溶液，室温静置1min，在12000rpm的转速下持续离心1min，洗脱DNA，得到DNA溶液，测下OD值并记录下来；三、对FLT3-ITD基因进行PCR扩增对PCR产物进行100倍的稀释，加入1ulPCR进行毛细管电泳；四、检测结构分析采用Genmapper软件进行数据分析，首先判断野生型是否出现，如果野生型出现，表明实验过程没有问题，再观察是否出现FLT3-ITD基因突变型，根据Genmapper软件给出的峰面积算出样本中FLT3-ITD基因突变比例。优选的，所述步骤a中的离心操作在室温条件下进行。优选的，所述步骤c中涡旋的时间为15s，室温孵育的时间为10min。优选的，所述步骤d中对样本离心操作的条件为12000rpm离心1min。优选的，所述步骤e中对样本离心操作的条件为12000rpm离心30s。优选的，所述步骤f中对样本离心操作的条件为12000rpm离心30s。优选的，所述步骤h中对样本离心操作的条件为12000rpm离心2min。优选的，所述步骤三中所使用的引物分别为FLT3-ITD-F：GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC，FLT3-ITD-R：CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC，其中FLT3-ITD-F引物5、端用FAM荧光标记。(三)有益效果与现有技术相比，本专利技术提供了基于毛细管电泳法定量检测FLT3-ITD基因突变的方法，具备以下有益效果：该基于毛细管电泳法定量检测FLT3-ITD基因突变的方法，采用毛细管电泳法结合PCR技术检测具有FLT3-ITD基因突变的白血病患者，其引物专门针对FLT3-ITD基因突变(不同片段长度的插入)而特异设计的，该方法特异性和稳定性好，解决了因FLT3-ITD基因插入不同片段长度而专门针对个体设计的引物和探针的荧光定量，只需设计一对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于毛细管电泳法定量检测FLT3-ITD基因突变的方法，其特征在于：包括如下步骤：/n一、材料及试剂的准备/n购入实验操作中所需的DNA提取试剂盒、PCR MIX、引物生工合成和甲酰胺；/n二、检测样本的处理/n准备:1-2ml外周血或骨髓血、DNA/RNA(OD260/280值1.8-2.0)的血样标本，按照试剂盒中提取DNA的步骤进行相关实验操作，具体步骤如下：/na、使用前在CB3和WB3中加入不同体积的无水乙醇并进行离心操作；/nb、准备2ml的离心管，在离心管中加入250μl待提取的全血；/nc、在步骤b的基础上加入20ul的蛋白酶K和500ul BB3于样本中，并在充分涡旋混匀后进行室温孵育；/nd、在步骤c的基础上将全部的混合溶液加入离心柱中进行充分离心，离心操作完成后弃流出液；/ne、在步骤d的基础上加入500ul CB3溶液(使用前请先检测是否加入无水乙醇)再次进行充分离心，离心操作完成后弃流出液；/nf、在步骤e的基础上加入500ul WB3溶液(使用前请先检测是否加入无水乙醇)再次进行充分离心，离心操作完成后弃流出液；/ng、在步骤f的基础上再次加入500ul CB3溶液(使用前请先检测是否加入无水乙醇)再次进行充分离心，离心操作完成后弃流出液；/nh、在步骤g的基础上再次进行充分离心操作，彻底去除残留的WB3；/ni、将离心柱置于一干净的离心管中，在柱子中央加入50-200ul预热EB溶液，室温静置1min，在12000rpm的转速下持续离心1min，洗脱DNA，得到DNA溶液，测下OD值并记录下来；/n三、对FLT3-ITD基因进行PCR扩增/n对PCR产物进行100倍的稀释，加入1ul PCR进行毛细管电泳；/n四、检测结构分析/n采用Genmapper软件进行数据分析，首先判断野生型是否出现，如果野生型出现，表明实验过程没有问题，再观察是否出现FLT3-ITD基因突变型，根据Genmapper软件给出的峰面积算出样本中FLT3-ITD基因突变比例。/n...

【技术特征摘要】
1.基于毛细管电泳法定量检测FLT3-ITD基因突变的方法，其特征在于：包括如下步骤：
一、材料及试剂的准备
购入实验操作中所需的DNA提取试剂盒、PCRMIX、引物生工合成和甲酰胺；
二、检测样本的处理
准备:1-2ml外周血或骨髓血、DNA/RNA(OD260/280值1.8-2.0)的血样标本，按照试剂盒中提取DNA的步骤进行相关实验操作，具体步骤如下：
a、使用前在CB3和WB3中加入不同体积的无水乙醇并进行离心操作；
b、准备2ml的离心管，在离心管中加入250μl待提取的全血；
c、在步骤b的基础上加入20ul的蛋白酶K和500ulBB3于样本中，并在充分涡旋混匀后进行室温孵育；
d、在步骤c的基础上将全部的混合溶液加入离心柱中进行充分离心，离心操作完成后弃流出液；
e、在步骤d的基础上加入500ulCB3溶液(使用前请先检测是否加入无水乙醇)再次进行充分离心，离心操作完成后弃流出液；
f、在步骤e的基础上加入500ulWB3溶液(使用前请先检测是否加入无水乙醇)再次进行充分离心，离心操作完成后弃流出液；
g、在步骤f的基础上再次加入500ulCB3溶液(使用前请先检测是否加入无水乙醇)再次进行充分离心，离心操作完成后弃流出液；
h、在步骤g的基础上再次进行充分离心操作，彻底去除残留的WB3；
i、将离心柱置于一干净的离心管中，在柱子中央加入50-200ul预热EB溶液，室温静置1min，在12000rpm的转速下持续离心1min，洗脱DNA，得到DNA溶液，测下OD值并记录下来；
三、对FLT3-ITD基因进行PCR扩增
对PCR产物进行100倍的稀释，加入1ulPCR进行毛细管电泳；
四、检测结构分析
采用Genmapper软件进行数据分...

【专利技术属性】
技术研发人员：何贵伦，张鹏，谢珍，唐春花，邢宽，李平，安雪茹，
申请(专利权)人：南京实践医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32