一种山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用。以待测山羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增山羊DNMT3B基因部分片段，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定山羊DNMT3B基因NC_030820.1:g.61500477_61500478位11‑bp插入/缺失多态性位点的基因型。该11‑bp插入/缺失多态性位点的不同基因型与陕北白绒山羊的产羔数性状存在显著相关关系，存在提高山羊产羔数性状的DNA标记。本发明专利技术提供的检测山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的方法，可应用于山羊分子标记辅助选择育种中，加快建立优良山羊遗传资源群体。

A detection method of insertion / deletion polymorphism of DNMT3b gene in goats and its application

The invention discloses a detection method for insertion / deletion polymorphism of DNMT3b gene of goat and its application. The whole genome DNA of goat was used as template, and partial fragments of goat DNMT3B gene were amplified by PCR. Agarose gel electrophoresis was used to identify the genotype of the 11 NC_030820.1:g.61500477_61500478 bp insertion / deletion polymorphism site of DNMT3B gene in goats based on electrophoresis results. There was a significant correlation between the different genotypes of the 11 \u2011 bp insertion / deletion polymorphism and the lambing number traits of Northern Shaanxi white cashmere goat, and there was a DNA marker to improve the lambing number traits. The method for detecting the insertion / deletion polymorphism of goat DNMT3b gene provided by the invention can be applied to goat molecular marker assisted selection breeding to accelerate the establishment of excellent goat genetic resource population.

【技术实现步骤摘要】
一种山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用
本专利技术属于生物技术与家畜育种领域，涉及山羊DNMT3B基因NC_030820.1:g.61500477_61500478位11-bp插入/缺失多态性位点的快速、准确分型检测及其在分子标记辅助选择(MAS)育种中的应用。
技术介绍
随着人们生活水平的提高，社会对山羊产品的需求不断加强，但近年来羊肉、羊奶、羊绒等羊产品严重短缺。在高产、优质和高效的山羊育种目标上，通过对在DNA水平上筛查的与山羊产羔数性状密切相关的DNA标记位点进行检测，并根据其基因多态性与产羔数性状的关联，从而可以加快建立优良产羔数性状山羊种群。标记辅助选择(MAS)是通过对目标基因所连锁的分子标记的基因型分析从而进行育种的一种方法，使用这种方法可以大幅度的缩短育种年限，针对某一性状专一选择，从而提高了育种效率。在众多的分子标记中，天然的分子遗传标记有单核苷酸多态性(SNP)、基因组结构变异(SV)、插入/缺失突变(InDel)三种。近年来，随着测序技术的不断升级与测序成本的降低，插入/缺失突变作为分子遗传标记而逐渐受到人们的重视。插入/缺失突变是发生在亲缘关系较近物种同一位点的序列不同大小片段(一般在50bp以下)的插入或缺失。而InDels的应用已经成为分子育种的热点：在繁殖方面，有报道山羊KDM6A内含子16bp的InDel可以显著的影响山羊的产羔数(Cuietal.,2018)；还有报道山羊LHX4第一内含子上存在的12bp的InDel可以显著的影响山羊的产羔数(Yanetal.,2018)。这些研究都表明挖掘InDels对动物分子育种具有重要的意义和参考价值。山羊DNMT3B基因位于13号染色体上，具有22个外显子与21个内含子。DNMT3B是DNMTs家族的重要成员，其编码的甲基转移酶是哺乳动物胚胎发育必需的酶。DNMT3B主要功能是从头甲基化，也有维持甲基化的功能。DNMT3B在早期胚胎发育中起主要作用，特别是在早期胚胎发育的晚期阶段(Okanoetal.,1999；Katoetal.,2017)。与DNMTs家族其他成员相比，DNMT3B可以作用于真核染色体卫星区域中重复DNA序列的CpG岛，为其添加甲基化，此功能是其他DNMT成员所不具备的。另外，卵母细胞甲基化也需要DNMT3B，DNMT3B的失活会导致小鼠胚胎死亡(Okanoetal.,1999；Hirasawaetal.,2008；Uysaletal.,2015；Katoetal.,2017)。近年来，使用全基因组关联分析已经揭示了山羊不同产仔数的遗传信息，并筛选到DNMT3B为山羊产多羔的关键基因(Laietal.,2016)。尽管大量研究和全基因组分析表明，DNMT3B在山羊的繁殖中发挥着关键作用。然而，DNMT3B多态性对山羊繁殖性状的影响尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用，可以快速建立优良性状的山羊遗传资源群体。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为扩增引物，利用PCR扩增包含山羊DNMT3B基因第21内含子(DNMT3B最后一个内含子)插入/缺失多态性位点的片段，对PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定待测山羊个体在所述插入/缺失多态性位点的基因型；所述插入/缺失多态性位点选自山羊DNMT3B基因NC_030820.1:g.61500477_61500478位11-bp插入/缺失多态性位点。优选的，所述引物对P1为：上游引物F：5'-CAAGACAGGTGCCCTCAAGA-3'(20nt)；下游引物R：5'-CAGATGCGCCCCCAACA-3'(17nt)。优选的，所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12～24s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12～24s，25～30个循环；72℃延伸10min。优选的，所述电泳采用质量浓度为3.0～3.5％的琼脂糖凝胶。优选的，根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(II)表现为209bp一条带纹，插入/缺失基因型(ID)表现为209bp和198bp两条带纹，缺失/缺失基因型(DD)表现为198bp一条带纹。一种山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括用于PCR扩增上述山羊DNMT3B基因21内含子区插入/缺失多态位点的引物对(例如，上述引物对P1)。上述山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的检测方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。优选的，所述插入/缺失多态性位点的缺失/缺失基因型(DD)可以作为提高山羊产羔数的DNA标记。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术根据山羊DNMT3B基因内含子区插入/缺失多态性位点(参考序列NC_030820.1:g.61500477_61500478)设计引物，以山羊基因组DNA为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。本专利技术对山羊(例如，陕北白绒山羊)DNMT3B基因插入/缺失多态性位点(参考序列NC_030820.1:g.61500477_61500478)进行基因型和基因频率分析，对该插入/缺失多态性位点与山羊生产性状进行关联分析，结果表明本专利技术检测的插入/缺失多态性位点能够作为山羊产羔数的分子标记位点，从而加快建立产羔数性状优良的山羊种群，提高良种选育速度。附图说明图1为山羊DNMT3B基因扩增产物(引物对P1)的琼脂糖凝胶电泳结果；M表示Marker。图2为山羊DNMT3B基因PCR扩增产物测序图，其中：黑色方框标出的部分表示11-bp插入序列：NC_030820.1:g.61500477_61500478inCGGCCAGGAGA。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。本专利技术利用PCR方法对所发现的山羊DNMT3B基因g.61500477_61500478位点(参考序列：NC_030820.1)突变可能产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与山羊产羔数性状进行关联分析，验证其是否存在可以作为山羊分子育种中标记辅助选择的分子标记。1.实验药品与试剂1.1生化试剂与生物学试剂：①TaqDNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；③MarkerI(购自天根生化科技(北京)有限公司)。1.2普通试剂：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：/n以待测山羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含山羊DNMT3B基因内含子区插入/缺失多态性位点的片段，对扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定所述插入/缺失多态性位点的基因型，所述插入/缺失多态性位点选自山羊DNMT3B基因NC_030820.1:g.61500477_61500478位11-bp插入/缺失多态性位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
以待测山羊基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含山羊DNMT3B基因内含子区插入/缺失多态性位点的片段，对扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定所述插入/缺失多态性位点的基因型，所述插入/缺失多态性位点选自山羊DNMT3B基因NC_030820.1:g.61500477_61500478位11-bp插入/缺失多态性位点。


2.根据权利要求1所述一种山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR采用的引物对为：
上游引物：5'-CAAGACAGGTGCCCTCAAGA-3'；
下游引物：5'-CAGATGCGCCCCCAACA-3'。


3.根据权利要求1所述一种山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12～24s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12～24s，25～30个循环；72℃延伸10min；所述电泳采用质量浓度为3.0～3.5％的琼脂糖凝胶。


4.根据权利要求1所述一种山羊DNMT3B基因插入/缺失多态性的...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋晓越，惠一晴，长孙伟光，李增辉，潘传英，陈宏，屈雷，朱海鲸，蓝贤勇，李新春，李陇平，董书伟，
申请(专利权)人：榆林学院，
类型：发明
国别省市：陕西;61