EGFR基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种EGFR基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用。本发明专利技术方法利用Lambda核酸外切酶既可以快速水解DNA双链中5’末端为两个碱基的突出结构且标记有荧光基团的单链，又可以连续水解双链DNA中具有5’磷酸化末端DNA单链的性质，将突变碱基识别、PCR产物单链化和荧光信号放大过程合并完成，极大地简化了整个检测流程，减少了检测时间，相对检出限低至0.01％，灵敏度高，在临床诊断、靶向用药指导和术后伴随检测等方面具有很好的应用前景。

Rapid fluorescent detection of EGFR gene exon 19 deletion mutation and its application

The invention discloses a fast fluorescent detection method and application of EGFR gene exon 19 deletion mutation. In the method of the invention, lambda nucleic acid exonuclease can rapidly hydrolyze the single strand with two bases at the 5 'end in the double strand of DNA and labeled with fluorescence group, and continuously hydrolyze the single strand with 5' phosphorylated end in the double strand of DNA. The process of mutation base recognition, PCR product single chain and fluorescence signal amplification are combined to complete, greatly simplifying the whole detection flow The relative detection limit is as low as 0.01% and the sensitivity is high. It has a good application prospect in clinical diagnosis, targeted drug guidance and postoperative concomitant detection.

【技术实现步骤摘要】
EGFR基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用
本专利技术涉及一种检测EGFR基因19号外显子缺失突变(EGFR19del)的快速、高灵敏度检测方法，属于基因突变检测领域，可以用于肺癌等的早期诊断、靶向药物用药指导和术后的伴随检测等领域。
技术介绍
肺癌是当今世界上发病率最高的癌症之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占75-80％[1]，是重要的肺癌类型。亚洲非小细胞肺癌患者中人表皮生长因子受体(EGFR)突变发生率高达35％[2]，是肺癌的重要标志物。EGFR是人表皮生长因子(EGF)促进细胞增殖过程中所结合的糖蛋白受体，EGF与EGFR结合后会使其发生二聚，EGFR胞内酪氨酸激酶结构域中的数个酪氨酸残基发生磷酸化，引发下游通路[3]，进而促进细胞增殖。若EGFR发生突变，会导致其过度激活，引发细胞恶性增殖，对此，一系列酪氨酸激酶抑制剂(TKI)型小分子药物得以研发和应用。研究表明，NSCLC患者对TKI的响应与其是否具有EGFR突变高度相关[4]。在各种EGFR突变中，19号外显子缺失突变(EGFR19del)最为常见，约占48％[5]。EGFR19del的主要类型为2235_2249delGGAATTAAGAGAAGC，可导致EGFR酪氨酸激酶结构域中E746-A750五个氨基酸残基的缺失，进而影响EGFR的结构。发展高灵敏度、可靠的EGFR19del的检测方法对于肺癌的早期诊断、TKI靶向用药等具有重要的指导意义。传统的突变检测方法主要针对组织活检。由于肿瘤具有异质性，组织活检难以反映全面的信息，且组织活检具有侵入性、滞后性，操作复杂，通常只能进行一次操作。为克服这些不足，近年来液体活检技术发展迅速。液体活检可以针对体液中的循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)等进行检测，可以更全面地反映肿瘤的突变信息，且操作安全、无侵入性。不仅可用于肿瘤的早期检测，还可进行多次跟踪检测。但是由于体液中存在着大量的正常细胞和野生型DNA，使得体液中突变DNA的丰度往往远低于组织样品中的突变丰度，这就要求突变检测方法具有很高的灵敏度。目前用于检测EGFR19del的方法主要有二代测序法(NGS)、数字液滴PCR法(ddPCR)和扩增阻碍突变系统法(ARMS)等。NGS灵敏度大幅提高，但其仪器成本高，检测周期长，难以实现实验室中的低成本便捷检测。ARMS成本较低，但其可靠的相对检出限仍仅为约0.1％；数字PCR检测结果准确，但其样品消耗量大、成本高，且可靠的相对检出限也只能达到约0.1％。λ核酸外切酶具有5’至3’DNA外切酶活性，可快速水解双链DNA(dsDNA)中具有5’磷酸化末端的DNA单链，但对于单链DNA(ssDNA)本身或5’-OH末端的双链DNA水解速率很慢。λ核酸外切酶在连续催化过程中与底物不分离，具有持续性，直至将5’磷酸化末端的底物单链水解完全。在我们对λ核酸外切酶的性质进行系统研究的过程中发现，该酶的活性中心处不仅分布有带正电的氨基酸残基可以吸引磷酸基团，同时还分布有较多疏水性氨基酸残基。当DNA双链中一条链的5’末端为两个碱基的突出结构，并且在5’末端标记有含疏水结构的非磷酸基团时，该链也可以被λ核酸外切酶水解[6]。利用此性质，我们在DNA一条单链的5’末端标记上FAM荧光基团，通过设计其末端碱基的种类，实现了对另一条链末端碱基是否存在错配的识别[7]。参考文献：[1]Sanger,F.,Nicklen,S.&Coulson,A.R.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1977,74,5463–5467.[2]Margulies,M.etal.Nature,2005,437,376–380.[3]HunterT.Cell,2000,100(1):113-127[4]PaezJG,PA,LeeJC.Science,2004,304(5676):1497.[5]MitsudomiT.,YatabeY.FebsJournal,2010,277(2):301-308.[6]Wu,T.,Yang,Y.,Chen,W.,Wang,J.,Yang,Z.,Wang,S.,Xiao,X.,LiM.,Zhao,M.NucleicAcidsResearch,2018,46(6),3119–3129.[7]Wu,T.,Chen,W.,Yang,Z.,Wang,J.,Xiao,X.,LiM.,Zhao,M.NucleicAcidsResearch,2018,46(4),e24.
技术实现思路
本专利技术的目的在于进一步开发和利用Lambda核酸外切酶的新性质，发展一种高灵敏度的检测EGFR基因19号外显子缺失突变的新方法。本专利技术提出的检测EGFR基因19号外显子缺失突变(EGFR19del)的方法原理如下：本专利技术的探针设计如图1所示。Lambda核酸外切酶要实现连续的切割需要同时具备两个条件：一是待水解单链的5’末端打开两个碱基，伸到酶的活性口袋区域；二是不被水解的互补链能顺利通过酶中心的纳米孔，使酶可以稳定结合在双链上，持续向下游移动。EGFR19号外显子缺失主要为2235位至2249位GGAATTAAGAGAAGC这15个核苷酸的缺失，野生链含有上述序列，突变链不含上述序列。针对这种结构差异特点，本专利技术利用Lambda核酸外切酶的上述两个必备条件特征，设计DNA单链荧光探针总长为12-15nt，5’末端标记FAM荧光基团，3’末端标记BHQ1猝灭基团，紧邻5’末端的两个碱基依次与突变链中所缺失序列区域3’方向下游的第5个和第4个碱基相对应，且将探针距5’末端的第1位和第2位碱基分别设计为T碱基和G碱基，使之与待测链上对应的T碱基和A碱基分别形成T:T错配和G:A错配，探针的其余碱基均与突变链序列上的对应碱基完全匹配。这一设计使得野生链在距探针5’末端第5位-第6位之间的区域内多出15个核苷酸，从而形成一种内环结构，悬挂在主干DNA双链之外。这种二级结构可极大地阻碍Lambda核酸外切酶与该双链DNA的结合和对探针的水解反应。而对于突变链，由于与探针形成了5’末端两个碱基突出、其它碱基完全匹配的适宜双链DNA底物，使得探针可以被Lambda核酸外切酶快速切割并释放出荧光信号。进一步地，利用Lambda核酸外切酶可以快速水解双链DNA(dsDNA)中具有5’磷酸化末端DNA单链的性质，本专利技术巧妙地将单链化过程和检测过程合并完成，极大地简化了整个检测流程，减少了检测所需的时间。具体做法是，在对样品中的待测DNA进行PCR扩增时，将正向引物设计为5’羟基末端，反向引物设计为5’磷酸末端。这样当PCR反应完成后，可直接加入λ核酸外切酶和荧光探针，λ核酸外切酶首先切除由反向引物延伸得到的DNA单链，释放出的正向引物延伸产物链紧接着在酶和探针的双重识别作用下被检测，获得突变链丰度的信息。基于上述研究，本专利技术首先提供了一种用于检测EGFR基因19号外显子缺失突变(EGFR19del)的探针，该本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测EGFR基因19号外显子缺失突变的探针，该探针为DNA单链，长度为12～15nt；EGFR基因19号外显子的缺失区域对应于该探针距5’末端的第5位和第6位碱基之间，或者第4位和第5位之间；且该探针5’末端的第1位和第2位碱基是错配的，使得探针与待检测的突变链形成5’末端两个碱基突出、其它碱基完全匹配的双链DNA；在探针的两端分别标记有荧光基团和猝灭基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测EGFR基因19号外显子缺失突变的探针，该探针为DNA单链，长度为12～15nt；EGFR基因19号外显子的缺失区域对应于该探针距5’末端的第5位和第6位碱基之间，或者第4位和第5位之间；且该探针5’末端的第1位和第2位碱基是错配的，使得探针与待检测的突变链形成5’末端两个碱基突出、其它碱基完全匹配的双链DNA；在探针的两端分别标记有荧光基团和猝灭基团。


2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针的序列如序列表中SEQIDNo：1或2或3所示。


3.如权利要求1所述的探针，其特征在于，荧光基团标记在所述探针5’末端的脱氧核糖核苷酸残基上，猝灭基团标记在所述探针3’末端的脱氧核糖核苷酸残基上。


4.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述荧光基团和相应的猝灭基团选自下列组合中的一种：FAM和BHQ1/DABCYL/TAMRA，TET和BHQ1/DABCYL，HEX和BHQ1/BHQ2/DABCYL，TAMRA和BHQ2，ROX和BHQ2，TexasRed和BHQ2，Cy5和BHQ2/BHQ3。


5.一种检测EGFR基因19号外显子缺失突变的方法，包括以下步骤：
1)对待测DNA进行PCR扩增，其中正向引物设计为5’羟基末端，反向引物设计为5’磷酸末端；
2)添加λ核酸外切酶反应缓冲液、步骤1)扩增得到的目标DNA和权利要求1～4任一所述的探针，混合均匀后加热至80～95℃，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵美萍，杨子煜，陈维，吴曈勃，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11