The invention belongs to the field of molecular biology, and relates to a detection device for gene fusion, in particular to a microfluidic detection device for gene fusion and a use method thereof. In this technical scheme, the fusion gene in the sample is detected by microfluidic technology. The device has the function of multiple identification of target gene. While realizing high-throughput gene fusion detection, it reduces the demand for complex algorithm and non-specific probe hybridization. The detection process is simpler, faster and has higher detection accuracy and sensitivity. This equipment is suitable for the detection of fusion genes, especially for the detection of samples with low fusion gene content.
【技术实现步骤摘要】
一种基因融合的微流控检测设备及其使用方法
本专利技术属于分子生物学领域,涉及一种基因融合的检测设备,具体涉及一种基因融合的微流控检测设备及其使用方法。
技术介绍
基因融合(genefusion)是基因结构变异的一种,它是指基因组中一个基因的一个片段和另外一个基因的片段发生了融合。一般是一个原癌基因(癌症相关基因)和一个转录活跃的片段连接激活了原癌基因的表达。例如在非小细胞肺癌中EML4和ALK的融合等。融合基因是指将两个或多个基因的编码区首尾相连.并置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下。目前应用到基因融合检测的技术主要有:实时聚合酶链反应(RT-PCR),荧光原位杂交(FISH),免疫组织化学染色法(IHC),新一代基因测序(NGS),或这些方法的组合。RT-PCR存在灵敏度低,样品易污染、假阳性率高的缺点;FISH和IHC存在实验过程繁琐、实验结果的判读主观性大且需要有经验专家来判读等缺点;而NGS的数据分析量较大,导致测序费用较大和时间较长,并且NGS对仪器设备的要求也较高。并且上述几种方法均存在检测通量有限的缺点,均不能满足实际应用的需要。为解决上述问题,科研人员将外显子微阵列芯片技术应用到了对基因融合的检测中(ExonArrayProfilingDetectsEML4-ALKFusioninBreast,Colorectal,andNon–SmallCellLungCancers,EvaLin,etal.,MolCancerResSeptember12009(7) ...
【技术保护点】
1.一种基因融合的微流控检测设备,融合基因包括相互连接的片段A和片段B,片段A和片段B分别位于融合位置上游和下游,所述片段B为野生型基因的一个DNA片段,野生型基因还包括片段B’,片段B’和片段B相互连接且分别位于断裂位点上游和下游,其特征在于,检测设备包括微流控芯片、捕获链、探针和PCR反应体系;/n微流控芯片包括功能化的基板和微通道板,微通道板包括第一表面和与第一表面相对的第二表面,微通道板的第一表面上设置有至少两条不交叉的凹槽,在凹槽的两端设有贯穿第一表面和第二表面的通孔;微通道板的第一表面与功能化的基板密封接合,微通道板和基板之间形成供流体流通的微通道阵列,微通道阵列由至少两条不交叉微通道组成,微通道板和基板之间可拆卸;/n捕获链包括第一捕获链和第二捕获链,第一捕获链与片段A的正义链互补,第二捕获链与片段B’的正义链互补;捕获链由如下方法固定在基板上:将微通道板的第一表面与功能化的基板密封接合,第一次形成微通道阵列,第一次形成的微通道阵列中的微通道包括Ⅰ类微通道和Ⅱ类微通道两部分;将含第一捕获链的溶液注入Ⅰ类微通道,并将含第二捕获链的溶液注入Ⅱ类微通道,使捕获链固定在基板上,在 ...
【技术特征摘要】
1.一种基因融合的微流控检测设备,融合基因包括相互连接的片段A和片段B,片段A和片段B分别位于融合位置上游和下游,所述片段B为野生型基因的一个DNA片段,野生型基因还包括片段B’,片段B’和片段B相互连接且分别位于断裂位点上游和下游,其特征在于,检测设备包括微流控芯片、捕获链、探针和PCR反应体系;
微流控芯片包括功能化的基板和微通道板,微通道板包括第一表面和与第一表面相对的第二表面,微通道板的第一表面上设置有至少两条不交叉的凹槽,在凹槽的两端设有贯穿第一表面和第二表面的通孔;微通道板的第一表面与功能化的基板密封接合,微通道板和基板之间形成供流体流通的微通道阵列,微通道阵列由至少两条不交叉微通道组成,微通道板和基板之间可拆卸;
捕获链包括第一捕获链和第二捕获链,第一捕获链与片段A的正义链互补,第二捕获链与片段B’的正义链互补;捕获链由如下方法固定在基板上:将微通道板的第一表面与功能化的基板密封接合,第一次形成微通道阵列,第一次形成的微通道阵列中的微通道包括Ⅰ类微通道和Ⅱ类微通道两部分;将含第一捕获链的溶液注入Ⅰ类微通道,并将含第二捕获链的溶液注入Ⅱ类微通道,使捕获链固定在基板上,在基板上形成捕获链条带,然后将微通道板从基板上拆卸;
PCR反应体系包括第一PCR反应体系和第二PCR反应体系,第一PCR反应体系用于获得第一PCR产物,第二PCR反应体系用于获得第二PCR产物;
第一PCR反应体系包括第一引物对,第二PCR反应体系包括第二引物对;第一引物对用于扩增融合基因片段,融合基因片段由相互连接的片段A和片段B组成;第二引物用于扩增野生型基因片段,野生型基因片段由相互连接的片段B和片段B’组成;
在基板上形成捕获链条带之后,第一PCR产物和第二PCR产物均用于与捕获链接触;第一PCR产物或第二PCR产物由如下方式与捕获链接触:将微通道板的第一表面与固定有捕获链条带的基板密封接合,第二次形成微通道阵列,第二次形成的微通道阵列中的微通道与捕获链条带之间形成交叉,交叉点为检测位点;在第二次形成的微通道阵列的微通道中注入单链化的第一PCR产物和/或单链化的第二PCR产物;第二次形成的微通道阵列的微通道包括Ⅰ’类微通道和Ⅱ’类微通道两部分;
探针为连接有报告分子的单链DNA,包括第一探针和第二探针;第一探针与片段A的正义链互补,第一探针同片段A的结合区域和第一捕获链同片段A的结合区域相异,第二探针与片段B的正义链互补;探针用于确认已被捕获链所捕获的靶片段,探针由如下方式与靶片段结合:首先,单链化的第一PCR产物和/或单链化的第二PCR产物均与捕获链在微通道中接触并充分反应;然后,在Ⅰ’类微通道中注射入第一探针,并在Ⅱ’类微通道注射入第二探针,使第一探针与第一捕获链所捕获的片段A的正义链接触,并使第二探针与第一捕获链或第二捕获链所捕获的片段B的正义链接触。
2.根据权利要求1所述的一种基因融合的微流控检测设备,其特征在于,所述第二探针的两端的碱基均为G;所述捕获链的3’端通过间隔物连接有氨基。
3.根据权利要求2所述的一种基因融合的微流控检测设备,其特征在于,第一引物对包括第一正向引物和第一反向引物,在第一PCR反应体系中第一正向引物的用量大于第一反向引物的用量;第二引物对包括第二正向引物和第二反向引物,在第二PCR反应体系中第二正向引物的用量大于第二反向引物的用量。
4.根据权利要求3所述的一种基因融合的微流控检测设备,其特征在于,所述微通道板的材料为聚二甲基硅氧烷。
5.根据权利要求4所述的一种基因融合的微流控检测设备,其特征在于,功能化的基板为表面具有醛基化修饰的基板,所述基板为载玻片。
6.根据权利要求5所述的一种基因融合的微流控检测设备,其特征在于,所述探针中的报告分子为生物素。
7.根据权利要求1-6中任一项权利要求所述的一种基因融合的微流控检测设备,其特征在于,所述片段A为人类EML4基因的一个DNA片段,所述野生型基因为人类ALK基因,所述片段B和片段B’的连接位置在ALK基因上的第20外显子上。
8.根据权利要求7所述的一种基因融合的微流控检测设备,其特征在于,所述融合基因为EML4-ALK融合基因变异体1,EML4-ALK融合基因变异体1由EML4的第1-13外显子和ALK的第20-29外...
【专利技术属性】
技术研发人员:李志恒·保罗,
申请(专利权)人:珠海澳加动力生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:广东;44
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