一种基于KASP的大鼠遗传质量监控SNP标记分型方法及试剂盒技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种基于KASP的大鼠遗传质量监控SNP标记分型方法及试剂盒，所能够检测的SNP位点包括48个：覆盖了大鼠20条常染色体和X性染色体，每条染色体上至少选择2个SNP位点，近交大鼠品系两两之间至少有5个SNP位点用于区分，该方法还包括针对大鼠SNP标记设计的KASP引物组和KASP预混液。根据本发明专利技术所述方法可以有效快速区分常见近交系大鼠品系，并可对近交系大鼠的遗传纯合度或遗传污染进行有效检测，对封闭群大鼠的遗传多样性进行快速检测以及对未知来源的大鼠进行溯源，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。

A method and kit of SNP marker typing for rat genetic quality monitoring based on kasp

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a rat genetic quality monitoring SNP marker typing method and kit based on kasp. The SNP loci that can be detected include 48: covering 20 autosomal and X-chromosome of rats, selecting at least 2 SNP loci on each chromosome, and at least 5 SNP loci between two inbreeding rat strains for distinguishing. The method also includes It includes kasp primer set and kasp premix designed for SNP labeling of rats. According to the method of the invention, the common inbred rat strains can be effectively and rapidly distinguished, the genetic homozygosity or genetic pollution of inbred rats can be effectively detected, the genetic diversity of closed group rats can be quickly detected, and the rats from unknown sources can be traced, which has the characteristics of intuitiveness, accuracy, flexibility and low cost, and is suitable for automatic and batch inspection Measurement.

【技术实现步骤摘要】
一种基于KASP的大鼠遗传质量监控SNP标记分型方法及试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于KASP的大鼠遗传质量监控SNP标记分型方法及试剂盒。
技术介绍
在生物医学研究中，实验动物的遗传质量是衡量其品质好坏的重要因素，利用遗传特性稳定的实验动物才能保证实验结果具有参考价值和可比性。《常用品系大鼠的基因组及SNP遗传标记分析》(华南理工大学，工程硕士论文，2018年4月)中提到对其进行定期的遗传检测是必不可少的：近交系动物同基因性、长期遗传稳定性、均一性、个体性、背景资料和数据较完善的特点，检测近交系动物的纯合度和遗传污染情况，为保证科学研究实验结果的可靠、稳定及完整提供了依据；封闭系动物个体具有遗传杂合性，个体间具有遗传多样性和差异性，从而类似人类群体遗传异质性遗传组成，在人类遗传研究，药物筛选、毒理实验、生物制品和化学制品的鉴定等方面起着不可替代的作用；目前封闭群动物普遍缺乏遗传检测方法和标准，我国封闭群大鼠的遗传质量主要是在繁育环节进行控制，然而生产管理与繁育方式的实际效果如何却无法进行评估，因此，需要定期的遗传检测对其生产管理及繁育方式等作出反馈及调整是必需的。生化标记基因检测、免疫标记基因检测以及毛色基因检测等传统的遗传质量检测方法存在着精确度不高以及检测标记少等局限性，这些检测方法已不再满足科学发展的需要。随着基因组学研究的不断进步，SNP标记开始逐渐被应用于各种实验动物的鉴定及遗传检测中，相比于传统的遗传质量检测方法，利用SNP标记具有操作简单快速、能鉴别出同源品系以及能进行大规模高通量检测的显著优点。传统的SNP检测方法如DNA测序、RFLP、SSCP、ASO等操作复杂，易出错；Taqman方法、质谱分析、DNA芯片、SNaPshot法等有着高效快速的优点，但需要投入昂贵设备或者高成本的试剂，也难以普及应用。KASP(KompetitiveAlleleSpecificPCR)，即竞争性等位基因特异性PCR技术，以其高度稳定性、准确性和低成本的特点，已经被广泛应用于高通量SNP分型，尤其在样本量大，SNP标记少时，KASP的应用特点最为显著。KASP在小到中等数量的标记应用中显示出了成本效益和可扩展的灵活性。但KASP分子标记的开发需要综合考虑目的区段DNA变异、多态性等因素，标记开发的成功率较低。CN109022592A公布了一种针对4种大鼠常用品系Wistar、GK、BN、SD的13个SNP标记，选择的SNP标记采用高通量测序及生物信息分析等技术开发的能用于快速鉴定四种常用品系(Wistar、GK、BN、SD)大鼠的SNP标记，所用的SNP检测技术为一代测序，方法繁琐，价格昂贵，不易于自动化应用。国内外对大鼠SNP遗传分析尚处于研究阶段，检测方法主要有二代测序、普通PCR结合Sanger测序、PCR-LDR等。因此，提供一种基于KASP的SNP分子标记分型技术，可以在快速鉴别大鼠遗传质量。本专利技术建立的大鼠基因型鉴别技术可以快速准确区分常见近交系大鼠品系，并可对近交系大鼠的遗传纯合度或遗传污染进行有效检测，对封闭群大鼠的遗传多样性进行快速检测以及对未知来源的大鼠进行溯源，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。
技术实现思路
为解决现有技术的上述问题，本专利技术筛选了用于大鼠遗传质量监控的SNP标记，并基于SNP标记设计了KASP引物组及KASP反应体系和条件，并将所述引物组应用于在大鼠遗传质量监控中。本专利技术的目的在于提供一种用于区分大鼠近交系的SNP标记分型方法，能够有效快速区分常见近交系大鼠品系，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。本专利技术另一目的在于提供一种检测大鼠近交系遗传纯合度的SNP标记分型方法，用于排除繁殖过程中的遗传污染以及检测大鼠近交系的遗传纯合度，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。本专利技术的另一目的在于提供一种未知近交系大鼠溯源的SNP标记分型方法，能够根据SNP标记分型对其来源进行鉴定，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。本专利技术的另一目的在于提供一种封闭系大鼠遗传多样性检测的SNP标记分型方法，能够对封闭群动物的遗传质量进行有效的控制，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。本专利技术的另一目的在于提供一种用于大鼠遗传质量监控的SNP标记分型试剂盒，可鉴别48个SNP位点的任何一个或多个，包括KASP引物组以及优化的KASP反应体系，其设计巧妙，具有直观性，准确性、灵活性和低成本的特点，适合自动化和批量检测。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种用于大鼠遗传质量监控SNP标记，相关信息如表1所示：表1大鼠48个SNP标记相关信息表1中的SNP位置是基于NCBIGenomeDataViewer选取的。优选的，SNP标记的开发方法如下：常用近交系大鼠品系两两之间至少有5个SNP标记可以用来检测；覆盖所有的20条常染色体和X染色体，每条染色体上至少选取2个SNP标记，染色体较长的适当增加SNP标记数量，使各标记可以相互验证，减少抽样误差。优选的，可根据实验需要对所需检测的SNP标记数进行调整、自由组合。进一步的，根据所述SNP标记的侧翼序列设计KASP引物组，引物组为两条等位基因特异性正向引物和一条通用反向引物。其中，KASP引物组是基于RattusnorvegicusRGSC6.0/rn6genome序列设计的；上游引物1中GAAGGTGACCAAGTTCATGCT序列为FAM荧光基团；下游引物2中的GAAGGTCGGAGTCAACGGATT序列为HEX荧光基团，引物组具体信息如表2所示：表2针对SNP标记的KASP引物组序列表本专利技术提供的基于KASP的SNP标记分型方法操作简单，将所述的KASP引物组和KASPMasterMix加入到含有DNA样本的PCR反应板中，进行PCR扩增，最终结果使用荧光检测仪进行分型即可。本专利技术还提供所述基于KASP的SNP标记分型的具体方法，可鉴别48个SNP位点的任何一个或多个，包括以下步骤：1.样本收集：无菌采集鼠尾1-2cm或大鼠安乐死后，无菌采集肾脏、肝脏、肺脏等组织；优选的，-20℃冻存备用；2.DNA提取：每个动物取30mg组织样本，提取DNA；优选的，使用组织基因组DNA提取试剂盒进行提取；优选的，-20℃冻存备用；3.KASP反应体系：2×KASP预混液、KASP引物组混合液和步骤2所述DNA，优选的，2×KASP预混液为KASPMasterMix，优选的，DNA浓度为10ng/μL；4.KASP反应条件：94℃预变性15min；94℃20s，退火温度61℃，每个循环降0.6℃，1min，循环10次；94℃20s，退火温度55℃1min，循环26次；94℃2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于KASP的大鼠遗传质量监控的SNP标记分型方法，其特征在于，所述SNP标记具体信息如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种基于KASP的大鼠遗传质量监控的SNP标记分型方法，其特征在于，所述SNP标记具体信息如下：



其中，SNP标记是基于NCBIGenomeDataViewer选取的。


2.根据权利要求1所述的SNP标记分型方法，其特征在于，所述SNP标记覆盖了大鼠20条常染色体和X性染色体。


3.根据权利要求1所述的SNP标记分型方法，其特征在于，至少2个SNP标记位于同一条染色体上。


4.根据权利要求1所述的SNP标记分型方法，其特征在于，近交系大鼠品系两两之间至少有5个SNP标记用于检测。


5.根据权利要求1所述的SNP标记分型方法，其特征在于，包含一组或多组用于检测所述SNP标记设计的KASP引物组，其中，所述KASP引物组为两条等位基因特异性上游引物和一条通用下游引物，具体序列如下：
用于检测SNP标记rs8161747的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:3所示；
用于检测SNP标记rs8155439的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:4～SEQIDNO:6所示；
用于检测SNP标记rs13454273的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:7～SEQIDNO:9所示；
用于检测SNP标记rs8157523的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:10～SEQIDNO:12所示；
用于检测SNP标记rs8169914的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:13～SEQIDNO:15所示；
用于检测SNP标记rs8170587的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:16～SEQIDNO:18所示；
用于检测SNP标记rs8170947的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:19～SEQIDNO:21所示；
用于检测SNP标记rs8162367的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:22～SEQIDNO:24所示；
用于检测SNP标记rs8168417的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:25～SEQIDNO:27所示；
用于检测SNP标记rs8150502的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:28～SEQIDNO:30所示；
用于检测SNP标记rs8158014的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:31～SEQIDNO:33所示；
用于检测SNP标记rs8146004的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:34～SEQIDNO:36所示；
用于检测SNP标记rs8168428的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:37～SEQIDNO:39所示；
用于检测SNP标记rs8156261的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:40～SEQIDNO:42所示；
用于检测SNP标记rs8168290的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:43～SEQIDNO:45所示；
用于检测SNP标记rs8143665的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:46～SEQIDNO:48所示；
用于检测SNP标记rs8159324的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:49～SEQIDNO:51所示；
用于检测SNP标记rs8156171的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:52～SEQIDNO:54所示；
用于检测SNP标记rs8169394的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:55～SEQIDNO:57所示；
用于检测SNP标记rs8160067的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:58～SEQIDNO:60所示；
用于检测SNP标记rs8163435的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:61～SEQIDNO:63所示；
用于检测SNP标记rs13457306的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:64～SEQIDNO:66所示；
用于检测SNP标记rs8160130的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:67～SEQIDNO:69所示；
用于检测SNP标记rs8157008的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:70～SEQIDNO:72所示；
用于检测SNP标记rs8170995的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:73～SEQIDNO:75所示；
用于检测SNP标记rs8170329的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:76～SEQIDNO:78所示；
用于检测SNP标记rs13450010的引物，核苷酸序列如SEQIDNO:79～SEQIDNO:81所示；
用于检测SNP标记rs1344778...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨玲焰，王立鹏，时长军，
申请(专利权)人：苏州西山生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32