一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法；该方法通过制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液、微生物对食品中维生素B12的增值转换、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定、总DNA的提取与鉴定、DNA定量检测和计算检测结果六个步骤，实现维生素B12的含量检测，该方法可操作性强，反映的是基质中总的维生素B12含量，优于只能针对某种特定结构维生素B12的仪器分析方法。

A method of detecting vitamin B12 in food based on quantitative DNA technology

The invention discloses a method for detecting vitamin B12 in food based on the quantitative DNA technology. The method realizes the content detection of vitamin B12 through six steps: preparing the suspension of Lactobacillus leishmanii standard bacteria, the value-added transformation of microorganisms to vitamin B12 in food, the inactivation and fixation of Lactobacillus leishmanii, the extraction and identification of total DNA, the quantitative detection of DNA and the calculation of detection results This method has strong operability and reflects the total content of vitamin B12 in the matrix. It is superior to the instrumental analysis method which can only be used for vitamin B12 with a specific structure.

【技术实现步骤摘要】
一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法
本专利技术涉及食品及乳品中维生素B12测定
，具体涉及一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法。
技术介绍
维生素B12是迄今为止人类发现最晚的一种B族维生素，对它的研究任然不够充分。维生素B12是一类化合物的统称，具有多种存在形式，如氰钴胺素（cyanocobalamin）、羟钴胺素（hydroxocobalamine）、甲钴胺素（mecobalamine）和5′-脱氧腺苷钴胺素（5′-deoxyadenosylcobalamin）等，由于维生素B12自身具有多种分子构造和差异化的生物效价，使得食品中维生素B12的检测成为技术上的难点，尤其在微量存在水平的食品中，使用人工合成或天然维生素B12均存在巨大的检测误差，严重影响了行业的发展与技术进步。国内外现有的测定方法都存在明显的技术局限,如文献报道的分光光度法、高效液相色谱/质谱法、电泳法、离子交换法和等离子发射光谱法等化学分析法，以有限的各别结构含量代表维生素B12总量，缺乏令人信服的理论支持；微生物检测法理论相对完整，但最终测量的是微生物代谢物产生的溶液混浊度，属于典型的模拟信号，导致即便微弱的色差或杂质就能干扰结果，可操作性极差。因此，维生素B12至今缺少实用完善的测定方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，旨在解决现有维生素B12检测方法可操作性低、重复性差的缺点的问题。为实现上述目的本专利技术采用的技术方案是：一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，包括如下步骤：（1）、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液；采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌，37℃厌氧培养，取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液；（2）、微生物对食品中维生素B12的增值转换：将食品中维生素B12转化为特定营养因子添加于测定用培养基，取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液添加于灭菌后的试样溶液试管中，然后放入恒温培养箱内进行定时增值；（3）、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定：对培养后的试样溶液进行灭活操作；（4）、总DNA的提取与鉴定：取1ml试样溶液试管中的菌液于灭菌离心管中12000r/min离心1min，弃上清，采用细菌DNA提取试剂提取待测液的总DNA，并经超微量分光光度计检测浓度和纯度；（5）、DNA定量检测：采用微滴式数字PCR进行结果分析，获得DNA拷贝数（y）；（6）、计算检测结果；样品维生素B12含量（x）与DNA拷贝数（y）成线性关系，根据标准量维生素B12和对应DNA拷贝数获得的回归方程及线性相关系数计算出维生素B12含量。进一步，所述步骤（2）中，莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液取25μL添加于121℃灭菌5min的试样溶液试管中，将试管放入恒温培养箱内，36℃±1℃培养20h。进一步，所述步骤（3）中，灭活操作是将培养完毕的试样溶液试管迅速置于68℃±1℃环境中，保温30min以后急速冷却到4℃±1℃。进一步，所述步骤（5）中，采用微滴式数字PCR进行结果分析按如下步骤完成：1）、配置反应体系：10μLddPCRMasterMix（2X），上下游引物各1.0μL，2.5μL探针，4.5μLddH2O，1μLcDNA模板，反应总体积为20μL。并用去离子水代替模板作为阴性对照；2）、生成微滴：将20ul样品反应体系加入到DG8cartridge微滴反应卡中，加入70ul微滴生成油（DGOil），时长2分钟后生成微滴；3）、微滴封膜密封：转移微滴进入96孔板内，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜密封，以防止油挥发，运行程序为：180℃，5s；4）、PCR反应：程序：37℃保温10min，95℃预变性10min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，98℃延伸15s，40个循环，最后98℃延伸5min，降至室温；5）、获取DNA拷贝数：将完成PCR的96孔板放入plateholder中组装好并放入微滴读取仪中，打开QuantaSoft软件，对96孔板中样品信息进行Setup，进行QX200实验，得到DNA拷贝数（y）。本专利技术的有益效果是：本专利技术在微生物方法基础上引入定量DNA技术，最大程度延伸了微生物方法对具有生物活性的维生素B12高度灵敏的优势，同时规避了微生物法可操作性低、重复性差的缺点，本专利技术可操作性强，反映的是基质中总的维生素B12含量，优于只能针对某种特定结构维生素B12的仪器分析方法。附图说明图1为本专利技术中由维生素B12和对应工作菌株DNA含量构成的散点图。具体实施方式以下结合优选实施方式对本专利技术作进一步说明：一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，包括如下步骤：（1）、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液；采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌，37℃厌氧培养，取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液；相较于常规微生物检测维生素B12，由于无需采用现有微生物方法中的透光率检测原理，因此无需进行肉汤培养二次增值，可简化操作工艺。（2）、微生物对食品中维生素B12的增值转换：将食品通过高温水解、沉淀和过滤等方法除去蛋白、脂肪和淀粉等干扰物质，保留的维生素B12作为特定营养因子用于莱士曼氏乳酸杆菌特异性增值培养，食品中维生素B12转化为特定营养因子后添加于测定用培养基；取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液25μL添加于121℃灭菌5min的试样溶液试管中，将试管放入恒温培养箱内进行增值，恒温培养控制36℃±1℃培养20h；该菌的增值量与食品中维生素B12成对应关系。（3）、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定：对培养后的试样溶液试管进行灭活操作；具体的灭活操作是将培养完毕的试样溶液试管迅速置于68℃环境中，保温30min以后急速冷却到4℃，或68℃±1℃环境中保温30min以后急速冷却到4℃±1℃；这样可使细菌停止生理活性避免后期数量波动，同时保持细胞线粒体中16SrDNA结构完整。（4）、总DNA的提取与鉴定：取1ml试样溶液试管中的菌液于灭菌离心管中12000r/min离心1min，弃上清，采用细菌DNA提取试剂提取待测液的总DNA，并经超微量分光光度计检测浓度和纯度；通过浓度和纯度可判定总DNA的提取是否成功。（5）、DNA定量检测：采用微滴式数字PCR进行结果分析，获取DNA拷贝数（y）；具体实现步骤是：1）、配置反应体系：10μLddPCRMasterMix（2X），上下游引物各1.0μL，2.5μL探针，4.5μLddH2O，1μLcDNA模板，反应总体积为20μL。并用去离子水代替模板作为阴性对照；其中leichmanniiF：GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA，leichmanniiR：ACTTAACCCAACATC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液；采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌，37 ℃厌氧培养，取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液；/n（2）、微生物对食品中维生素B12的增值转换：将食品中维生素B12转化为特定营养因子添加于测定用培养基 ，取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液添加于灭菌后的试样溶液试管中，然后放入恒温培养箱内进行定时增值；/n（3）、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定：对培养后的试样溶液进行灭活操作；/n（4）、总DNA的提取与鉴定：将试样溶液试管中的菌液于灭菌离心管中12000 r/min 离心1 min，弃上清，采用细菌DNA提取试剂提取待测液的总DNA，并经超微量分光光度计检测浓度和纯度；/n（5）、DNA定量检测：采用微滴式数字PCR进行结果分析，获得DNA拷贝数（y）；/n（6）、计算检测结果；样品维生素B12含量（x）与DNA拷贝数（y）成线性关系，根据标准量维生素B12和对应DNA拷贝数获得的回归方程及线性相关系数计算出维生素B12含量。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液；采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌，37℃厌氧培养，取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液；
（2）、微生物对食品中维生素B12的增值转换：将食品中维生素B12转化为特定营养因子添加于测定用培养基，取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液添加于灭菌后的试样溶液试管中，然后放入恒温培养箱内进行定时增值；
（3）、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定：对培养后的试样溶液进行灭活操作；
（4）、总DNA的提取与鉴定：将试样溶液试管中的菌液于灭菌离心管中12000r/min离心1min，弃上清，采用细菌DNA提取试剂提取待测液的总DNA，并经超微量分光光度计检测浓度和纯度；
（5）、DNA定量检测：采用微滴式数字PCR进行结果分析，获得DNA拷贝数（y）；
（6）、计算检测结果；样品维生素B12含量（x）与DNA拷贝数（y）成线性关系，根据标准量维生素B12和对应DNA拷贝数获得的回归方程及线性相关系数计算出维生素B12含量。


2.如权利要求1所述的一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液取25μL添加于121℃灭菌5min的试样溶液试管中，将试管放入恒温培养箱内，36℃±1℃培养20h。


3...

【专利技术属性】
技术研发人员：祖新，
申请(专利权)人：甘肃省食品检验研究院甘肃省动物源性食品基因检测中心，
类型：发明
国别省市：甘肃;62