一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法技术

本发明专利技术提供的鉴别中国人参的DNA杂交方法中使用的探针是基于人参属基因组中达玛烯二醇合酶(dammarenediol synthase)基因的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位点设计。本发明专利技术人实验中发现中国人参、西洋参和三七的达玛烯二醇合酶基因相似性高，为了更加准确的鉴别中国人参，发明专利技术人设计了多种探针序列，最后筛选出了可以准确鉴别中国人参的探针序列。

A DNA Hybridization Method for Identification of Chinese Ginseng

The probe used in the DNA hybridization method for identifying Chinese ginseng is based on the single nucleotide polymorphism (SNP) site design of dammarenediol synthase gene in ginseng genome. In the experiment of the inventor, it was found that the Damarenol synthase genes of Chinese ginseng, American ginseng and Panax notoginseng had high similarity. In order to identify Chinese ginseng more accurately, the inventor designed a variety of probe sequences, and finally screened out the probe sequences that could accurately identify Chinese ginseng.

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法
本专利技术涉及一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法。
技术介绍
中药材人参在分类学上,属于Plantae(植物界)，Apiales(伞形目)，Araliaceae(五加科)，Aralioideae(人参亚科)，Panax(人参属)。人参属下有三个主要的种分类：PanaxGinseng(亚洲参/中国人参)，Panaxnotoginseng(三七)和PanaxQuinquefolius(西洋参)。虽然中国人参、三七和西洋参起源于同一属，但三种中药材的用途和性质有不同。如中国人参并不会影响华法林(Warfarin)药物的效果，但是西洋参可以显著影响华法林的抗凝血活性性质。另外非人工养殖的、自然生长的中国人参价格也比三七和西洋参要高得多。由于中国人参、三七和西洋参功效各异、价值相差大，对中国人参快速鉴别的技术和手段对于保护消费者权益显得十分重要。然而中国人参、三七和西洋参三种中药材在外观形态学和化学指纹图谱上都极度相似，鉴别中国人参至今仍然是一个十分大的挑战。基于人参属基因组达玛烯二醇合酶(dammarenediolsynthase)基因的单核苷酸多态性建立的DNA条形码技术，为准确鉴别中国人参提供了一种新方法。但是现在用于鉴别中国人参的DNA条形码技术，步骤都会包括形成PCR产物和序列鉴别2步，并且都涉及凝胶电泳分离(gelelectrophoreticseparation)，过程涉及电场作用及特殊染色，需要花费大量时间和操作技术上的成本，快速鉴别中国人参的需求任然无法满足，因此需要提供一种快速鉴别中国人参的技术。微流控芯片，是一种操控流体在微小通道中流动的系统，能够大幅减少样品消耗，减少样品处理时间，提高检测分辨率/灵敏度，在疾病诊断、药物筛选、环境检测、食品安全等领域中有广阔的使用前景。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法。一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，所述方法的探针序列为SEQIDNO：2。所述用于鉴别中国人参的DNA杂交方法中使用的洗涤液为金纳米颗粒溶液。所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的粒径为5nm，金纳米颗粒的浓度为5-20nM。所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的浓度为5nM。所述金纳米颗粒溶液中起稳定作用的DNA浓度为8nM。所述用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，为基于微流控芯片的方法，所述微流控芯片包括测试板和流道板，所述流道板表面刻有一条以上、互不交叉的的微流道；调整所述流道板与所述测试板的叠放位置，在所述测试板表面形成相互交叉的探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹，所述探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹交叉处为反应区。所述通道板的数量为不少于1块。所述用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其操作步骤包括：(1)探针加入到微流控芯片中，沿探针固定轨迹被固定到所述测试板表面；(2)洗涤微流控芯片后，移除流道板，分别洗涤和吹干流道板和测试板，重新叠放流道板和测试板；(3)将生物素标记的单链待测样本DNA加入到微流控芯片中，待测样本DNA沿待测样本DNA流动轨迹流动，在反应区与固定的探针杂交；(4)除去微流道芯片中的溶液，洗涤微流道芯片，在微流道芯片中加入Cy-5标记的链霉亲和素溶液；(5)洗涤和干燥微流道芯片，取测试板用激光扫描仪扫描荧光信号。一种鉴别中国人参的DNA杂交方法试剂盒，所述试剂盒包括微流控芯片、Cy-5标记的链霉亲和素溶液、洗涤溶液、溶解液、探针；所述微流控芯片包括测试板和流道板，所述流道板表面刻有一条以上、互不交叉的的微流道；调整所述流道板与所述测试板的叠放位置，在所述测试板表面形成相互交叉的探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹，所述探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹交叉处为反应区；所述探针序列为SEQIDNO：2，所述的溶解液用于溶解和稀释所述探针和待测样本DNA。所述的溶解液成分为含0.15MNaCl、0.015MPH7.0的柠檬酸钠缓冲液、0.15％十二烷基苯磺酸钠的溶液。所述洗涤溶液为NaCl-NAHCO3水溶液、NABH4溶液、1倍PBS缓冲液，金纳米颗粒溶液、含0.15％吐温的1倍PBS缓冲液。本专利技术提供的鉴别中国人参的DNA杂交方法中使用的探针是基于人参属基因组中达玛烯二醇合酶(dammarenediolsynthase)基因的单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)位点设计。本专利技术人实验中发现中国人参、西洋参和三七的达玛烯二醇合酶基因相似性高，为了更加准确的鉴别中国人参，专利技术人设计了多种探针序列，最后筛选出了可以准确鉴别中国人参的探针序列。本专利技术提供的鉴别中国人参的DNA杂交方法将微流控芯片和基因多态性检测相结合，一方面保留了微流控芯片无需电泳、可以使用体积小(0.5μL)和低浓度(为0.1nM)样品、可同时检测多个样品、以及反应速度快的优点，另一方面也保留了基因多态性检测准确度高的优点，因此本专利技术的鉴别中国人参的NA杂交方法检测性能优越。附图说明图1微流控芯片示意图其中1为测试板，2为通道板。图2微流控芯片使用原理示意图其中3为探针固定轨迹；4为待测样品DNA轨迹；5为反应区；图2-a为探针加入微流控芯片时，测试板1和通道板2的叠放位置示意图；图2-b为探针固定轨迹3示意图；图2-c为待测样品DNA加入微流控芯片时，测试板1和通道板2的叠放位置示意图；图2-d为探针固定轨迹3和待测样品DNA轨迹4交叉状态示意图；图2-e为测试板用激光扫描仪扫描荧光信号下的示意图。图3探针筛选结果Pgin为中国人参的待测样本DNA反应区，Pquin为西洋参的待测样本DNA反应区；A为N1G探针的反应区，B为N2G探针的反应区。图4探针鉴定人参验证具体实施方式为了更好理解本专利技术的技术方案和优点，以下通过具体实施方式，并结合附图对本专利技术做进一步说明。实施例11、各种溶液配置探针溶液的配置取溶解液与探针，配置探针溶液，其中配置成的探针溶液成分如下：(1)25μM胺标记的寡核苷酸单链(2)1.5MNaCl(3)0.15M碳酸氢钠(4)0.15％十二烷基苯磺酸钠(SDS)待测样本DNA溶液的配置取溶解液与待测样本DNA，配置待测样本DNA溶液，其中配置成的待测样本DNA溶液成分如下：(1)25ng/uL生物素标记的寡核苷酸单链(2)0.015MNaCl(3)0.015M柠檬酸钠(pH7.0)(4)0.15％十二烷基苯磺酸钠(SDS)金纳米颗粒(AuNP)溶液的配置实验前将AuNP储存液加至AD6(注：AD6是一条单链DNA，序列为：CGCCGATTGGACAAAACTTAAA)及PBS等混合溶液中，进行如下操作：(1)以8000rpm离心5秒(离心分离至管底)，然後振荡数秒；(2)将离心管置于95℃上加热10min，取出在室温下冷却90min；(3)加入1倍PBS溶液，随后进行离心和振荡，该溶液需在1h内使用。2、实验操作步骤(1)1μL探针溶液加入到微流控芯片中，室温反应1小时，让探针沿探针固定轨迹被固定到测试板表面；(2)移除探针溶液，用NaCl-NaHCO3水溶液(含1.5MNaCl，0.15MNaHCO3)洗涤微流控芯片，移除流道板，放测试板在2.5mg/mL的Na本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于所述方法的探针序列为SEQ ID NO：2。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于所述方法的探针序列为SEQIDNO：2。2.如权利要求1所述的用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于所述方法中使用的洗涤液为金纳米颗粒溶液。3.如权利要求2所述的用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的粒径为5nm，金纳米颗粒的浓度为5-20nM。4.如权利要求3所述的用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的浓度为5nM。5.如权利要求4所述的用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于所述金纳米颗粒溶液中起稳定作用的DNA浓度为8nM。6.如权利要求1所述的用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于所述方法为基于微流控芯片的方法，所述微流控芯片包括测试板和流道板，所述流道板表面刻有一条以上、互不交叉的的微流道；调整所述流道板与所述测试板的叠放位置，在所述测试板表面形成相互交叉的探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹，所述探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹交叉处为反应区。7.如权利要求6所述的用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于所述通道板的数量为不少于1块。8.如权利要求6所述的用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志恒，奥伯克·克里斯托弗，
申请(专利权)人：珠海澳加动力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44