一种HPV基因芯片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种HPV基因芯片，该基因芯片能单独或同时对一种或多种HPV亚型准确检测、筛选和分型，且有人基因组β珠蛋白和HPV引物扩增质控点来监控整个检测过程，该HPV基因芯片能够具有高灵敏度和特异性；本发明专利技术还公开了该HPV基因芯片的制备方法，利用PCR反向点杂交法筛选特异性强的探针，通过对HPV基因芯片的点样探针浓度优化，提高了杂交的质量和效率，并用临床样品进一步验证了优化好条件的基因芯片。本发明专利技术的HPV基因芯片具有较好的临床应用前景。

A HPV Gene Chip and Its Preparation and Application

The invention discloses an HPV gene chip, which can accurately detect, screen and type one or more HPV subtypes individually or simultaneously, and the whole detection process is monitored by human genome beta globin and HPV primer amplification quality control points. The HPV gene chip has high sensitivity and specificity. The invention also discloses the preparation method of the HPV gene chip, and uses PCR anti-virus. The specific probe was screened by dot hybridization. The quality and efficiency of hybridization were improved by optimizing the concentration of dot probe in HPV gene chip. The optimized gene chip was further verified by clinical samples. The HPV gene chip of the invention has good clinical application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种HPV基因芯片及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种HPV基因芯片及其制备方法和应用。
技术介绍
宫颈癌是女性疾病常见的恶性肿瘤之一，其发病率占全球女性肿瘤第四位。据近年来数据统计发现，我国宫颈癌患者越来越年轻化，且其发病率和死亡率仍保持在较高水平，因此宫颈癌前病变的早期筛查，对宫颈癌的预防有很大作用，从而引起了研究者对宫颈癌早期筛查的的极高重视。1983年，德国科学家Hausen提出了HPV是宫颈癌病因的学说，此后很多国内外研究学者做了大量关于宫颈癌与HPV感染的关系研究，并取得了大量的收获。大量数据研究表明，高危型HPV持续性感染是导致宫颈癌发生的必要因素。已有研究结果显示，大约有30种高危型HPV能引起宫颈病变，尤其是HPV16亚型和HPV18亚型。HPV是一种双链环状无包膜的DNA病毒，属于乳多空病毒(papovaviridae)的乳头瘤空泡病毒A属，其基因组长约8000bp。按照HPV功能划分为3个区域，分别是长控制区(LCR)、早期转录区(E区)和晚期转录区(L区)。E区包括E1～E7，负责编码病毒相关蛋白；L区包括L1和L2，编码病毒的主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)，L1约占衣壳蛋白的80％，序列高度保守，L2含量较少，变异较多；LCR区含有基因组的复制起点和表达所需的调控元件，参与调控病毒的转录与复制。由于HPVL1区域是HPV基因组中最为保守的一段序列，因此可根据病毒开放阅读框基因编码核甘酸序列的同源性差异来对病毒进行分型，按照HPV导致宫颈癌风险的高低将其分为高危型HPV(HRHPV)和低危型HPV(LRHPV)，高危型HPV主要有以下类型，如HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、67、68、69、73等型别；低危型HPV包括HPV6、11、40、42、43、44、54、55、57、61、71、81、83等型别，其中低危型HPV主要导致湿疣类病变，而高危型HPV可能导致宫颈癌的发生。大量研究表明，HPV感染与宫颈癌变有着密切的关系。由于HPV可在体内潜伏10年甚至更长时间，且不出现任何临床症状，人们很容易忽略HPV检测，这就导致了宫颈癌前病变发展到宫颈癌的过程极为漫长。因此，在临床上将HPV检测作为常规筛查的一部分十分重要，通过早期检查提高HPV早期检出率，从而提高宫颈癌前病变的治愈率，最终预防宫颈癌的发生，降低宫颈癌的发病率。HPV检测及分型在宫颈癌筛查、早期预防、临床诊断及后期治疗等方面具有十分重要的价值。目前尚未出现HPV体外培养的方法，HPV检测方法主要是细胞学和分子生物学检测法。传统的细胞学检测方法如巴氏涂片法检测的准确率、灵敏度和重复率低，且假阴性率和假阳性率极高，不能对HPV分型。随着人们对HPV检测及分型方法的深入研究，HPVDNA/RNA检测对宫颈病变早期筛查的作用日益显现，相比传统的细胞学检测方法更为灵敏、准确。目前HPV分子生物学诊断方法可以分为3类：核酸杂交法，信号放大技术和核酸扩增技术。荧光原位杂交法能定位，假阳性率低，但是其检测灵敏度低，操作繁琐，费时耗力，并不适合大通量临床样品的筛选。1999年杂交捕获二代技术(HCⅡ)批准用于HPV检测，该技术由美国Digene公司推出，是最早获得美国食品药物管理局(FDA)批准，世界应用最广泛的HPV检测技术，虽然HCⅡ检测特异性好且灵敏度高，但是HCⅡ存在不能进行分型检测，费用成本高，且无内质控等缺陷。2011年美国FDA批准了Cobas4800HPV技术的一线初筛，该技术能定性检测14种高危型的HPV，且有β珠蛋白作为内质控，但其检测HPV类型仅限于这14种高危类型。近年来，HPV检测方法在临床上的应用仍然存在一些缺陷，如不能对HPV多种亚型进行一次性检测，操作过程繁琐，检测费用高，且耗时耗力等。虽然许多公司关于宫颈癌筛查研制出了很多HPV检测试剂盒，但这些试剂盒多少存在一些缺陷，所以在确保HPV检测全面的同时，保证HPV检测试剂盒的质量更为重要。由于HPV基因型具有不同的潜在致癌性，所以对临床可疑标本进行具体的分型有助于准确分析和治疗。因此，建立一种新型的HPV基因芯片，能快速准确地对HPV进行检测及分型十分重要。生物芯片(biochip或bioarray)是采用微缩技术，将不连续的分析过程集成于固相载体的微型分析系统，能够实现对样品组分的高通量检测。基因芯片与DNA微阵列技术都属于生物芯片，均是采用阵列方式设定在平面基质载体上，并行处理生物样本中多个基因信息的微处理单元，生物芯片具有微型化和并行处理大量临床样本的特征。鉴于基因芯片技术的优势，采用基因芯片技术，实现大量临床样本平行检测及高通量分析。基因芯片工作原理是将特异性探针点在膜上，制备基因芯片，与被特定标记物标记的DNA扩增产物进行杂交和显色，经过扫描分析检测样本HPV型别。基因芯片技术是目前临床诊断运用最广泛的技术，它在HPV检测方法上起到了关键性的作用，为宫颈癌患者的诊断带来了福音。近年来基因芯片技术作为一项低消耗、高灵敏度、高通量检测方法，已经被广泛应用于医学研究领域，对HPV的检测及分型具有十分广阔的临床应用前景，因此，研发一种新型的HPV检测方法对HPV的检测及精准分型有着非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过运用基因芯片技术，制备一种新型的HPV基因芯片，该基因芯片能一次性检测30种HPV亚型，其中涵盖了19种高危型HPV和11种低危型HPV，且有人基因组β珠蛋白作为质控点来监控整个检测过程，使得该HPV基因芯片能够具有高灵敏度和特异性，并能够运用在临床上。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种HPV基因芯片，以BiodyneC膜为载体，膜上包含一个以上HPV亚型检测点和两个阳性质控点，其中两个阳性质控点分别检测人基因组β珠蛋白基因和HPV引物扩增。前述的HPV基因芯片中，所述的两个阳性质控点中的检测人基因组β珠蛋白基因的探针序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：5中任一所示，并且在5’端标记氨基，即PC(PositiveControl)阳性质控点；检测HPV引物扩增的探针序列如SEQIDNO：6～SEQIDNO：10中任一所示，并且在5’端标记氨基，即QC(QualityControl)阳性质控点。前述的HPV基因芯片中，所述HPV亚型检测点包括高危型HPV和/或低危型HPV检测点。前述的HPV基因芯片中，所述高危型HPV包含HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、67、68、69和73亚型中的一种或几种；所述低危型HPV包含HPV6、11、34、40、42、43、44、54、55、57和62亚型中的一种或几种。前述的HPV基因芯片中，所述HPV6亚型的探针序列如SEQIDNO：11～SEQIDNO：15中任一所示；所述HPV11亚型的探针序列如SEQIDNO：16～SEQIDNO：20中任一所示；所述HPV16亚型的探针序列如SEQIDNO：21～SEQIDNO：25中任一所示；所述HPV18亚型的探针序列如SEQIDNO：26～SEQIDNO：30中任本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HPV基因芯片，其特征在于，以Biodyne C膜转印膜为载体，膜上包含一个以上HPV亚型检测点和两个阳性质控点，其中两个阳性质控点分别检测人基因组β珠蛋白基因和HPV引物扩增。

【技术特征摘要】
1.一种HPV基因芯片，其特征在于，以BiodyneC膜转印膜为载体，膜上包含一个以上HPV亚型检测点和两个阳性质控点，其中两个阳性质控点分别检测人基因组β珠蛋白基因和HPV引物扩增。2.根据权利要求1所述的HPV基因芯片，其特征在于，所述的两个阳性质控点中的检测人基因组β珠蛋白基因的探针序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：5中任一所示，检测HPV引物扩增的探针序列如SEQIDNO：6～SEQIDNO：10中任一所示，并且在5’端均标记氨基。3.根据权利要求1或2所述的HPV基因芯片，其特征在于，所述HPV亚型检测点包括高危型HPV和/或低危型HPV检测点。4.根据权利要求3所述的HPV基因芯片，其特征在于，所述高危型HPV包含HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、67、68、69和73亚型中的一种或几种；所述低危型HPV包含HPV6、11、34、40、42、43、44、54、55、57和62亚型中的一种或几种。5.根据权利要求4所述的HPV基因芯片，其特征在于，所述HPV6亚型的探针序列如SEQIDNO：11～SEQIDNO：15中任一所示；所述HPV11亚型的探针序列如SEQIDNO：16～SEQIDNO：20中任一所示；所述HPV16亚型的探针序列如SEQIDNO：21～SEQIDNO：25中任一所示；所述HPV18亚型的探针序列如SEQIDNO：26～SEQIDNO：30中任一所示；所述HPV26亚型的探针序列如SEQIDNO：31～SEQIDNO：35中任一所示；所述HPV31亚型的探针序列如SEQIDNO：36～SEQIDNO：40中任一所示；所述HPV33亚型的探针序列如SEQIDNO：41～SEQIDNO：45中任一所示；所述HPV34亚型的探针序列如SEQIDNO：46～SEQIDNO：50中任一所示；所述HPV35亚型的探针序列如SEQIDNO：51～SEQIDNO：55中任一所示；所述HPV39亚型的探针序列如SEQIDNO：56～SEQIDNO：60中任一所示；所述HPV40亚型的探针序列如SEQIDNO：61～SEQIDNO：65中任一所示；所述HPV42亚型的探针序列如SEQIDNO：66～SEQIDNO：70中任一所示；所述HPV43亚型的探针序列如SEQIDNO：71～SEQIDNO：75中任一所示；所述HPV44亚型的探针序列如SEQIDNO：76～SEQIDNO：80中任一所示；所述HPV45亚型的探针序列如SEQIDNO：81～SEQIDNO：85中任一所示；所述HPV51亚型的探针序列如SEQIDNO：86～SEQIDNO：90中任一所示；所述HPV52亚型的探针序列如SEQIDNO：91～SEQIDNO：95中任一所示；所述HPV53亚型的探针序列如SEQIDNO：96～SEQIDNO：100中任一所示；所述HPV54亚型的探针序列如SEQIDNO：101～SEQIDNO：105所示；所述HPV55亚型的探针序列如SEQIDNO：106～SEQIDNO：110中任一所示；所述HPV56亚型的探针序列如SEQIDNO：111～SEQIDNO：115中任一所示；所述HPV57亚型的探针序列如SEQIDNO：116～SEQIDNO：120中任一所示；所述HPV58亚型的探针序列如SEQIDNO：121～SEQIDNO：125中任一所示；所述HPV59亚型的探针序列如SEQIDNO：126～SEQIDNO：130中任一所示；所述HPV62亚型的探针序列如SEQIDNO：131～SEQIDNO：135中任一所示；所述HPV66亚型的探针序列如SEQIDNO：136～SEQIDNO：140中任一所示；所述HPV67亚型的探针序列如SEQIDNO：141～SEQIDNO：145中任一所示；所述HPV68亚型的探针序列如SEQIDNO：146～SEQIDNO：150中任一所示；所述HPV69亚型的探针序列如SEQIDNO：151～SEQIDNO：155中任一所示；所述HPV73亚型的探针序列如SEQIDNO：156～SEQIDNO：160所示；并且在5’端均标记氨基。6.权利要求1～5任一所述的HPV基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)HPV检测标准品的制备；(2)HPVL1区DNA片段靶标的扩增；(3)HPV引物及探针设计及合成；(4)HPV基因芯片的制备。7.根据权利要求6所述的HPV基因芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)HPVL1区DNA片段靶标的扩增中使用的4条正向引物为det-1A、det-1B、det-1C和det-1D，其中det-1A的序列如SEQIDNO：161～SEQIDNO：165中任一所示，det-1B的序列如SEQIDNO：166～SEQIDNO：170中任一所示，det-1C的序列如SEQIDNO：171～SEQIDNO：175中任一所示，det-1D的序列如SEQIDNO：176～SEQIDNO：180中任一所示，4条反向引物为GP-1A、GP-1B、GP-1C和GP-1D，其中GP-1A的序列如SEQIDNO：181～SEQIDNO：185中任一所示，GP-1B的序列如SEQIDNO：186～SEQIDNO：190中任一所示，GP-1C的序列如SEQIDNO：191～SEQIDNO：195中任一所示，GP-1D的序列如SEQIDNO：196～SEQIDNO：200中任一所示，其中4条反向引物5’末端均用生物素标记，并加入人基因组β珠蛋白基因扩增引物一同扩增，HPV扩增引物与人基因组β珠蛋白基因扩增引物的浓度比为1:6～1:4，所述人基因组β珠蛋白基因扩增引物PC04和GH20序...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈腾祥，江银辉，徐澍，兰金芝，禹文峰，张金娟，王欢，肖俊，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52