一种检测致病性弧菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测致病性弧菌的方法，涉及致病性弧菌检测技术。该检测方法采用如下引物对中的一种或多种的组合进行PCR：SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3‑4、SEQ ID NO.5‑6、SEQ ID NO.7‑8、SEQ ID NO.9‑10、SEQ ID NO.11‑12、SEQ ID NO.13‑14、SEQ ID NO.15‑16、SEQ ID NO.17‑18以及SEQ ID NO.19‑20；利用该方法可对常见的致病弧菌如霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等进行检测，避免非特异性扩增，具有较强的特异性和较高的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种检测致病性弧菌的方法
本专利技术涉及致病性弧菌检测
，具体而言，涉及一种检测致病性弧菌的方法。
技术介绍
食源性疾病是当今世界上最广泛的卫生问题之一，发病率居人类各种疾病首位，世界卫生组织(WHO)的数据表明，食源性和水源性腹泻病每年导致约220万人死亡，其中多数是儿童；在工业化国家，每年有超过30％的人口患有食源性疾病。致病性弧菌(PathogenicVibrio)是一类重要的食源性病原菌，广泛存在于自然水环境，特别是海水中，对海产品有较大程度的污染。我国沿海省份有着广阔的海域和丰富的海产品，居民爱吃海产品，历来有生食或半生食贝类、甲壳类等海产品的习惯。近年来进出口海产品中致病性弧菌的检出屡见不鲜，致病性弧菌污染引起的食源性疾病爆发已成为突出的公共卫生问题，严重危害人民的身体健康并造成经济财产损失。致病性弧菌主要包括霍乱弧菌(Vibriocholerea,V.c)、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus,V.p)、创伤弧菌(Vibriovulnificus,V.v)、河流弧菌(Vibrioflurialis,V.f)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus,V.a)、拟态弧菌(Vibriomimicus,V.m)等12种。前两种弧菌危害大、致病率高。霍乱弧菌是一种古老而流行广泛的烈性病原体之一，被WHO定为国际检疫菌；近年来以肠道门诊监测为基础的食源性疾病主动监测结果显示，副溶血性弧菌是导致食源性疾病发病最多的细菌性病原微生物；创伤弧菌、河弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌等致病性弧菌的感染亦十分普遍。报道指出浙江省进口食品被创伤弧菌污染食品引起的食物中毒是最为严重的食源性疾患之一，免疫力低下患者致死率达50％～60％；河流弧菌在我国沿海地区海水中检出率约为6％～15％，海产品中检出率为4％～5％；溶藻弧菌数量位居海水类弧菌之首，能够引起食物中毒、中耳炎、败血症、脑膜炎等严重疾病而未受到重视；拟态弧菌腹泻症状与霍乱弧菌所致腹泻症状极为相似，典型症状都是米泔水样便。目前致病性弧菌的检测方法有标准检测和快速检测两种，其中标准方法主要基于生理、生化指标，利用在高盐条件下产酸、产气以及生长代谢方面等特性进行鉴定。这些方法操作步骤繁琐，对操作人员技术水平要求比较高，且检测的周期长，在相当大的程度上限制了致病性弧菌快速检测、鉴定的能力。随着分子生物学技术的发展，许多方法如PCR、酶联免疫荧光方法、胶体金方法等已经应用到致病性弧菌的检测中，大大的缩短了检测的周期。在这些技术的基础上又开发了AFLP、RFLP等方法。这些检测方法的建立在一定程度上提高了检测的效率，缩短了检测的周期，但是上述技术也存在各自的弊端。如PCR方法易出现污染导致假阳性结果，而且一些阳性结果还需要测序鉴定；酶联免疫荧光技术存在检测灵敏度不高等缺点。随着人民生活水平的提高，消费者对食品卫生提出了更高的标准，单一弧菌的检测方法已不再适用现今多重检测的迫切需求。有研究发现创伤弧菌可能与副溶血性弧菌一起通过牡蛎等海水产品复合感染生食者。虽然北欧食品协会的“食品中致病性弧菌的检测和计数”分别规定了4种致病性弧菌的检测方法，但仍难以反映海产品被其他致病性弧菌污染的真正状况。现在国内关于致病性弧菌的国家标准和行业标准检测方法仅限于传统的微生物学检测方法，每种检测方法只能检测一种致病性弧菌。而国外的传统微生物学检测方法(如FDA、AOAC、ISO等)也是以检测单一或少数目标菌为目的设计的程序。每检测一种致病性弧菌都需配制不同的培养基和试剂，费时费力。目前，API20E和VITEK等作为成熟的微生物快速鉴定系统已经被应用于致病性弧菌的检测，然而临床常见的12种弧菌用自动化鉴定系统仅63.1％～80.9％可正确鉴定到种级水平。在分子生物学检测方法方面，目前FDA2004标准仍是以检测一种致病性弧菌为目的设计PCR程序，检测不同的弧菌需要不同的反应条件。近年来，多种检测新方法应用到致病性弧菌的检测中。VezzulliL等新近寻找到霍乱弧菌一种高度保守序列——N-乙酰氨基葡萄糖结合蛋白A(GbpA)基因，在此基础上开发出一种新型荧光定量PCR方法用以检测纯培养物、海水、沉积物、粪便、福尔马林固定样本等样本中霍乱弧菌的存在，研究表明该方法可从1966年8月福尔马林固定样本中检出霍乱弧菌。ZhangX.等建立了一种CPA霍乱弧菌初筛方法，能够对各种血清型的霍乱弧菌进行鉴别，检测限达到2CFU/mL，表现出比环介导等温扩增(LAMP)方法更高的灵敏度和实用性。LowK.F.等将超敏电化学基因检测技术应用到霍乱弧菌特异性lolB基因序列的检测中，该方法采用磁珠作为生物识别相，通过乳胶-纳米金颗粒进行信号放大杂交标签，检测限同样达到了2CFU/mL。近年来用多重靶标检测致病性弧菌的报道逐渐增加。KurakawaT等针对霍乱弧菌/拟态弧菌、副溶血性弧菌/溶藻弧菌rRNA基因建立了RT-qPCR检测方法，检测限达到了10个细胞/克粪便，但是仅为两重检测方法。SenachaiP等针对霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌特异性基因设计特异性引物，建立了一种四重PCR方法用于食品安全评估。ParkJY等建立了一种多重实时荧光RT-PCR检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法，检测限达到了10CFU/反应。由以上报道的方法可以看出，现有的致病性弧菌多重检测方法能够检测的弧菌种类最多不超过4种，应用的方法受技术本身限制存在检测限高、检测时间长、容易出现假阳性等问题。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于致病性弧菌检测的核酸组合，该核酸组合可检测出待测样品中的致病性弧菌例如霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌，具有特异性好、灵敏和可靠等特性。本专利技术的另一目的在于提供上述核酸组合的应用，将其用于制备致病性弧菌检测试剂盒，该试剂盒具有特异性好、灵敏度高、结果可靠等特点。本专利技术的另一目的在于提供一种致病性弧菌检测试剂盒，其含有上述的核酸组合，可以针对霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等致病性弧菌进行检测。该试剂盒具有检测快速、操作方便、灵敏度高、特异性好、检测结果可视、结果准确等诸多优点。本专利技术的另一目的在于提供一种致病性弧菌的检测方法，该检测方法可以针对霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等致病性弧菌进行检测，具有检测快速、操作方便、灵敏度高、特异性好、检测结果可视、结果准确等诸多优点。本专利技术是这样实现的：一方面，本专利技术提供了一种用于致病性弧菌检测的核酸组合，其包括如下引物对中的一种或多种的组合：用于检测霍乱弧菌toxR基因(toxR(V.c))的第一引物对，其包括：SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物；用于检测霍乱弧菌ctxAB基因的第二引物对，其包括：SEQIDNO.3所示的上游引物和SEQIDNO.4所示的下游引物；用于检测副溶血性弧菌toxR基因(toxR(V.p))的第三引物对，其包括：包括SEQIDNO.5所示的上游引物和SEQIDNO.6所示的下游引物；用于检测副溶血性弧菌tlh基因的第四引物对，其包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测致病性弧菌的方法，其特征在于，其包括：对待测样本的DNA进行PCR扩增反应；所述PCR扩增反应的PCR反应体系中含有如下引物对中的一种或多种的组合：用于检测霍乱弧菌toxR基因的第一引物对，其包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；用于检测霍乱弧菌ctxAB基因的第二引物对，其包括：SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；用于检测副溶血性弧菌toxR基因的第三引物对，其包括：包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；用于检测副溶血性弧菌tlh基因的第四引物对，其包括：SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物；用于检测副溶血性弧菌tdh基因的第五引物对，其包括：SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物；用于检测副溶血性弧菌trh基因的第六引物对，其包括：SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物；用于检测创伤弧菌vvhA基因的第七引物对，其包括：SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物；用于检测拟态弧菌toxR基因的第八引物对，其包括：SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物；用于检测河流弧菌toxR基因的第九引物对，其包括：SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物；用于检测溶藻弧菌coIH基因的第十引物对，其包括：SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物；各引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有用于与催化酶结合的第一亲和物。...

【技术特征摘要】
1.一种检测致病性弧菌的方法，其特征在于，其包括：对待测样本的DNA进行PCR扩增反应；所述PCR扩增反应的PCR反应体系中含有如下引物对中的一种或多种的组合：用于检测霍乱弧菌toxR基因的第一引物对，其包括：SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物；用于检测霍乱弧菌ctxAB基因的第二引物对，其包括：SEQIDNO.3所示的上游引物和SEQIDNO.4所示的下游引物；用于检测副溶血性弧菌toxR基因的第三引物对，其包括：包括SEQIDNO.5所示的上游引物和SEQIDNO.6所示的下游引物；用于检测副溶血性弧菌tlh基因的第四引物对，其包括：SEQIDNO.7所示的上游引物和SEQIDNO.8所示的下游引物；用于检测副溶血性弧菌tdh基因的第五引物对，其包括：SEQIDNO.9所示的上游引物和SEQIDNO.10所示的下游引物；用于检测副溶血性弧菌trh基因的第六引物对，其包括：SEQIDNO.11所示的上游引物和SEQIDNO.12所示的下游引物；用于检测创伤弧菌vvhA基因的第七引物对，其包括：SEQIDNO.13所示的上游引物和SEQIDNO.14所示的下游引物；用于检测拟态弧菌toxR基因的第八引物对，其包括：SEQIDNO.15所示的上游引物和SEQIDNO.16所示的下游引物；用于检测河流弧菌toxR基因的第九引物对，其包括：SEQIDNO.17所示的上游引物和SEQIDNO.18所示的下游引物；用于检测溶藻弧菌coIH基因的第十引物对，其包括：SEQIDNO.19所示的上游引物和SEQIDNO.20所示的下游引物；各引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有用于与催化酶结合的第一亲和物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在PCR反应体系中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比大于1，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比大于1。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在PCR反应体系中，各引物对的上游引...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩嘉钰，云振宇，黄盈，吴琦，赵琳，刘菲，周航，彭丽，
申请(专利权)人：四川华汉三创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51