基于微流控芯片检测多种病原体的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种基于微流控芯片检测多种病原体的试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守序列的引物及Taqman荧光探针。本发明专利技术的试剂盒采用的是微流控芯片技术，加样后所有操作都由仪器完成，操作简便，速度快，可在30～60min内完成检测，且不会造成污染；采用Taqman探针荧光PCR技术，针对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌进行检测，设计引物和探针的序列在肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μL。

【技术实现步骤摘要】
基于微流控芯片检测多种病原体的试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,MP)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae,CP)和嗜肺军团菌(Legionellapneumoniae,LP)感染是全球重要的感染性疾病，可在各年龄组儿童发病，以呼吸道感染最为常见，感染部位可贯穿整个呼吸道，且具有一定的传染性。MP、CP、LP是儿童急性上呼吸道感染常见的致病菌，也是引起社区获得性肺炎的主要病原菌。三种病原菌引起的肺炎支原体肺炎、肺炎衣原体肺炎和嗜肺军团菌肺炎为非典型肺炎，在症状、体征及辅助检查方面无特异性，病原体检测有局限性，易于误诊，利用分子技术可以快速、准确地进行诊断，从而配合正确的治疗，减少抗菌药物的滥用。由这三种病原体引起的呼吸道感染所占比重较高，且三者的混合感染也日渐增多，同时检测、快速检测三种病原体的产品越来越有需求。利用多重荧光PCR分子诊断技术可以达到对三种病原体的快速同步检测，对临床早期诊断有着非常重要的意义。肺炎支原体是无细胞壁，介于病毒和细菌之间能自我复制进行独立生活的最小微生物，革兰氏染色阴性。MP可以引起支原体肺炎、上呼吸道感染、支气管炎、肺脓疡、免疫性溶血性贫血、脑膜脑炎、心肌炎、心包炎、肾炎、社区获得性肺炎等疾病。MP有很强的传染性，主要由口、鼻分泌物以气溶胶微粒的形式通过呼吸道传播，其潜伏期较长，存在全年散发、秋冬季高发的特点，会小范围内流行，引起集体感染，如幼儿园、学校、家庭成员交叉感染等。文献报道的阳性检出率达到15％～35％，另外，15％～20％社区获得性肺炎是由肺炎支原体引起的，在儿童社区获得性肺炎中更是占到20％左右。肺炎衣原体是介于病毒与细菌之间的专属细胞内寄生的病原体，在宿主细胞内生长、繁殖和形成包涵体。传染途径与MP一样是通过呼吸道分泌物在人-人之间传播，在半封闭环境可存在小范围流行。根据遗传学和生物学分为TWAR、考拉和马3个生物变种，代表株为TW-183T(ATCCVR2282T)，是一种常见的人类呼吸道致病菌。CP可以引起急性呼吸道感染如咽炎、喉炎、鼻窦炎中耳炎、支气管炎及肺炎等，以肺炎最常见，支气管炎次之；还可以引起心肌炎、心内膜炎、动脉硬化和冠心病、虹膜炎、肝炎、脑膜炎和关节炎等疾病。潜伏期约为10天，一年四季均可感染，其流行可呈散发性或爆发性传播，尤其在空间相对封闭、人群聚集较多、空气不太流通的公共场所，文献报道的阳性检出率5％～20％。目前的诊断主要靠病原体的分离和血清学抗体的检测，但时间长、操作复杂，而荧光PCR检测可用于急性感染诊断及特殊人群流行病学研究。嗜肺军团菌是引起军团病的病原菌，是人类单核细胞和巨噬细胞的兼性胞内寄生菌，系革兰氏阴性杆菌，是一类水源微生物，通过嗜肺军团菌有15个血清型，都有致病性。其中I型在人军团菌肺炎中最常常见，估计70％～90％的军团菌病是由I型嗜肺军团菌引起的。初期症状为轻微的咳嗽、不舒服、肌肉酸痛、低热或者还有些消化道症状，与普通感冒和流感症状类似，所以在临床上很难诊断；后期症状是高热、下呼吸道感染和肺炎的表现，X线可以看到明显的肺部病变，部分患者可出现并发症，如心包炎、心肌炎、心内膜炎、急性肾功能衰竭、休克等。潜伏期2～10天，嗜肺军团菌从饮用水系统、空调冷却水、淋浴喷头水等与人群密切接触水体以气溶胶的形式经呼吸道传播给人，引起严重的肺部炎症-军团菌病，使用中央空调的公共场所是传播嗜肺军团菌感染的重要高危场所。流行高峰为夏秋季，散发病例全年均有发生，男女发病比例2：1。本病主要发生于细胞免疫功能低下，如糖尿病、恶性肿瘤、器官移植、肝肾衰竭者。文献报道的阳性率3％～9％，暴露人群行业中10％～25％。微流控芯片(microfluidics)或称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反应，分离、检测等基本操作单元或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。这种技术原则上适用于从核酸、蛋白质直到有机、无机小分子的各种不同类型分子的反应、分离和检测。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点,它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。目前市场上针对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的检测方法主要有荧光PCR法、免疫法和细菌培养法，其中培养法占一半以上，其次是免疫法，分子检测法所占比重最少。荧光PCR法是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因；免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白；培养法是把病原体在特定培养基上进行培养，再对产生的结果进行观察分析。市面上已注册的有单项/两项的检测试剂盒，但没有同时检测三种病原菌的产品。目前市面上暂无利用荧光定量PCR法检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的同类试剂盒，但有这三种病原体单项或者包含这三种病原体的多项检测荧光定量PCR法试剂盒的技术方案公开，可以作为参照进行比对，其组成一般包括盐离子缓冲液、酶、引物、探针、质控品，以液态形式分管保存在-20℃下，使用时需要将多管试剂融化，按照一定的比例进行混合，配制成检测反应液，然后加入样本核酸，放入荧光定量PCR仪中进行检测，最后根据扩增曲线分析检测结果。免疫法检测试剂针对的是样本中病原体引起机体产生的特异性抗体，抗体的检测有窗口期，在发病初期容易漏诊，且灵敏度、特异性较低，样本易污染且干扰物质较多，浓度过高或者过低时都容易造成结果错判，需要重复检测、复查才能确诊，检测的可信度较差；采用培养法检测耗时一般在一天以上，培养效果差，很多病原体无法培养，延误最佳治疗时机。普通的荧光PCR检测试剂虽然具有较好的灵敏度和特异性，但是试剂盒一般为多管液态试剂构成，平时需要保存在-20℃环境中，在操作时需要将各管试剂按照比例混合使用，对于保存运输条件、操作方法等方面有较高的要求，容易因保存不当和操作失误引起检测结果不可信。同时由于甲型流感病毒和乙型流感病毒的亚型种类很多，检测试剂盒一般针对的是甲型流感病毒和乙型流感病毒最为常见的亚型，有时因为病毒毒株的变异，可能会产生漏检的情况。由于荧光定量PCR仪检测后的结果需要专业人员来对扩增曲线分析，有时候会有人为误差产生。最后，因为荧光定量PCR仪的升降速度较慢，检测时间一般在1～2个小时，耗时较长。另外，肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的混合感染日渐增多，而三者感染引起的肺炎在症状、体征及辅助检查方面没有特异性，易于误诊，针对这种情况市面上检测单项病原体的产品无法满足快速检测、区分三种病原体的需求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种可同时快速检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌三种病原体的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，该基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守序列的引物及Taqman荧光探针；其中，特异性保守序列的引物序列为：肺炎支原体，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；肺炎衣原体，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；嗜肺军团菌，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；特异性Taqman探针序列为：肺炎支原体，SEQ ID NO.3；肺炎衣原体，SEQ ID NO.6；嗜肺军团菌，SEQ ID NO.9。

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守序列的引物及Taqman荧光探针；其中，特异性保守序列的引物序列为：肺炎支原体，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；肺炎衣原体，SEQIDNO.4和SEQIDNO.5；嗜肺军团菌，SEQIDNO.7和SEQIDNO.8；特异性Taqman探针序列为：肺炎支原体，SEQIDNO.3；肺炎衣原体，SEQIDNO.6；嗜肺军团菌，SEQIDNO.9。2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述预装干粉检测试剂还包括有PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl2、HotStartTaq酶、逆转录酶和UNG酶。3.根据权利要求2所述的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50～500nM；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％w/v；所述HotStartTaq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度为0.5U～5U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度均为0.1mM～2mM；所述MgCl2在扩增体系中的终浓度为1.5mM～10mM。4.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中含有肺炎支原...

【专利技术属性】
技术研发人员：许行尚，杰弗瑞·陈，王龙，于沛，张蓉蓉，
申请(专利权)人：南京岚煜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32