一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒。所述试剂盒包括检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ和反应液Ⅳ。本发明专利技术的有益效果在于：提供了一种高通量，高灵敏度、高特异性的用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，比现有的显色法基因芯片步骤少，检测时间明显缩短，同时比有机荧光基因芯片设备成本低，利于临床的推广。

【技术实现步骤摘要】
一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒。
技术介绍
尿路感染(UrinaryTractInfection，UTI)是指致病微生物侵袭泌尿系统而导致的炎症，是危害人类健康的常见病之一；根据感染部位可分上、下尿路感染。其病情反复发作，迁延不愈，可由无症状细菌尿至严重的毒血症，各种年龄及性别均可发病，以女性常见。其发病率比较高，仅次于呼吸道和消化道的感染性疾病。以尿频、尿急、尿痛等膀胱刺激征为主要临床表现，部分患者还伴有发热和耻骨上压痛等症状，如治疗不及时，还可引起菌血症、急性或慢性肾功能不全等并发症状。引起尿路感染的病原菌主要分为三类：革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌，此外，一些病毒、衣原体和寄生虫也会引起尿路感染。其中革兰氏阴性菌主要包括：大肠杆菌、奇异变形菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌等；革兰氏阳性菌主要包括：粪肠球菌、屎肠球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌等；而真菌以白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、季也蒙假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌等为主。超过95％的尿路感染是一种致病菌引起。其中尿路感染患者中所分离的致病菌的前四位分别是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和屎肠球菌，占总致病菌的80％以上，而大肠杆菌位于第一位。大肠杆菌最常见于无症状细菌尿、非复杂性尿路感染，或首次发生的尿路感染。腐生性葡萄球菌的症状性尿路感染较常发生于性生活活跃的女性。医院内感染的尿路感染、复杂性尿路感染、复发性尿路感染和尿路器械检查后发生的尿路感染，则多为粪链球菌、变形杆菌、克雷伯杆菌和绿脓杆菌所致。金黄色葡萄球菌常见于败血症等血源性尿路感染，各种厌氧性菌则很少引起尿路感染。量子点(Quantumdot，QD)又称半导体纳米晶，呈近似球形，其三维尺寸在2-10nm范围内，具有明显的量子效应。量子点一般由II-VI族元素(如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、ZnS等)或III-V族元素(无镉量子点，如InP、InAs等)等半导体材料构成，也可由两种或两种以上的半导体材料构成核/壳结构(如常见的CdSe/ZnS核/壳结构量子点等)。量子点的物理、光学、电学特性远优于现有有机荧光染料，具有灵敏度高、稳定性好、货架期长等优势，是新一代荧光标记探针的最佳选择。量子点作为标记探针尤其适用于高灵敏度、多指标同时检测等应用领域，其优势如下：1)量子荧光效率高，摩尔消光度系数大，其荧光强度比现有最强的有机荧光材料光强强20倍以上，适用于高灵敏度检测，结合高分辨荧光显微镜可实现单量子点示踪；2)具有很好的光稳定性，耐光漂白，适用于长时间稳定激发动态观察以及结果存档；3)荧光寿命长，有机荧光染料或生物样本背景荧光寿命一般仅为1-10纳秒，而量子点的荧光寿命可持续10-100纳秒，通过时间分辨特性，可降低背景干扰，提高灵敏度；4)发射波长因组成成分和粒径大小而异，易于制备经表面修饰后特性相似但发射波长不同的量子点；5)宽泛且连续的吸收光谱，实现单一光源多色激发；6)发射光谱窄而对称，可减少多色激发过程中不同量子点之间的干扰；7)量子点具有较大的斯托克斯位移，易与斯托克斯位移较小的有机荧光染料和背景荧光相区分，可通过调整激发光波长或使用滤光片，消除背景，提高灵敏度。8)表面修饰后具有更好的生物相容性，与多种生物分子偶联，无非特异吸附。量子点材料在20世纪80年代分别由AlexeyI.Ekimov在玻璃基质中，以及LouisE.Brus在胶体溶液中合成，随后量子点表面配基化学修饰技术逐步完善。由于量子点相对于传统荧光染料具有诸多优点，在1998年Alivisatos和Nie将量子点应用于生物分子标记，使用生物活性分子如抗体或抗原等连接在量子点表面修配体的活性基团上，实现了量子点生物荧光染色，开创了量子点生物标记材料的应用研究。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，形成微阵列，所以可以一次性对临床样品中大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(SouthernBlotting和NorthernBlotting等)技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。由于基因芯片技术具有高通量、高速度、高效率的检测特征，所以为高通量的病原菌检测鉴定提供了强有力的检测工具。但是目前基因芯片主要以有机荧光染料、BCIP/NBT、DAB及有机荧光为检测方法，有机荧光染料基因芯片存在很多缺陷：制备工艺复杂，检测过程复杂繁琐，而且检测仪器需要费用高昂的激光扫描仪，不利于临床的推广。BCIP/NBT及DAB方式存在操作步骤繁琐，检测灵敏度低，重复性差等技术上的缺陷。目前，最常用的病原菌的检测方法是细菌培养和药敏试验，即细菌经培养后进行生理生化鉴定。然而，培养法有很多不足的地方，如耗时较长，一些难培养的病原菌不易培养等会影响患者及时治疗。随着技术发展，现在更多研究偏向于分子诊断，利用分子技术可以快速准确检测到病原菌种类及耐药情况，极大提高了治疗的效率。目前国内外所涉及到技术主要包括基因芯片、多重PCR技术、荧光定量PCR技术、PCR-反向斑点杂交等。但目前的实时荧光定量PCR仪的通量受限问题而不能进行高通量的检测。现有的相关专利如下：申请号为CN201710153149.7的中国专利技术专利公开了一种检测尿液病原菌的试剂盒，主要检测微生物的ATP。申请号为CN200910250899.1的中国专利技术专利公开了一种基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法，针对血液感染的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的16SrRNA基因的保守区域，设计相应的PCR通用引物并荧光标记，然后采用PCR反应对血液样本中的病原菌进行扩增以及电泳检测。申请号为CN201610116239.4的中国专利技术专利公开了一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片及其技术应用，本专利主要针对6种尿路病原菌(大肠埃希菌、奇异变形菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌)进行检测。申请号为CN201611230917.6的中国专利技术专利公开了一种VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片的制备和用途，可同时检测5种耐药基因和3种相关的病原菌，包括抗万古霉素肠球菌VRE耐药基因VanA,VanB，编码新德里金属-β-内酰胺酶NDM-1耐药基因，抗甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的耐药基因mecA，编码碳青霉烯酶KPC基因，以及粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌。申请号为CN201110276409.2的中国专利技术专利公开了一种高通量的细菌耐药基因检测芯片及其应用。基因芯片含有117条基因探针,耐药基因探针选自17大类耐药基因，包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因。该芯片用于病原菌耐药基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ和反应液Ⅳ；所述反应液I包含以下检测引物：引物J23F1：GAGATTTCCGAATGGGGAAACCCA；引物J23R1：TTCACCTTTCCCTCACGGTACTG；引物BMTL23R1：TCAGCATTCGCACTTCTGAT；引物CTF1：GACGGAAGTCTGACGAAGCG；引物CN16R1：CGCATTTCACYGCTACACGT；引物NGF1：CGTGTCTGAAGAAGGCCTTC；引物MUF1：CYATYACTGACGCTTAGGCT；引物MUR1：GTTGCGGGACTTAACCCAACA；引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG；引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG；所述反应液II包含以下检测引物：引物TUF1：GAATTGGTTGAAATGGAAAT；引物TUR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA；引物CNSF1:GAATTGGTTGAAATGGAAAT；引物CNSR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA；引物FKYBIF1:TGCTCACACAGATTGTCTG；引物YGR1:CAGGCGCTCTCCCAGCTGAG；引物FKR1:ATCCAGATTTTTAAAGAGCA；引物QYR1:CTTGTTCCAGATTGTTAAAGAGCA；引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG；引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG；所述反应液III包含以下检测引物：引物VANF1:TAGGCTGCGATATTCAAAGCTC；引物VANR1:AACAGCCTGCTCAATTAAGATTTT；引物VANR2:CCGACCTCACAGCCCGAAA；引物MEF1:CGTTCAATTTAATTTTGTTAAA；引物MER1:TTTTAGATACATTCTTTGGAAC；引物ECOF1:GTCTGCAATTGCCACCACTG；引物ECOR1:GCCGAATCGCTGCTGGAAG；引物ECOF2:CATATCTTCTTCCAGATTGC；引物ECOR2:GCTGTTTGGCTATGAGGAAG；引物ITSF1:GGTTTCCGTAGGTGAAC；引物ITSR1:GCATCCCACGGGCTCTCACC；引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG；引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG；所述反应液IV为Hotstart Taq DNA聚合酶。...

【技术特征摘要】
1.一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ和反应液Ⅳ；所述反应液I包含以下检测引物：引物J23F1：GAGATTTCCGAATGGGGAAACCCA；引物J23R1：TTCACCTTTCCCTCACGGTACTG；引物BMTL23R1：TCAGCATTCGCACTTCTGAT；引物CTF1：GACGGAAGTCTGACGAAGCG；引物CN16R1：CGCATTTCACYGCTACACGT；引物NGF1：CGTGTCTGAAGAAGGCCTTC；引物MUF1：CYATYACTGACGCTTAGGCT；引物MUR1：GTTGCGGGACTTAACCCAACA；引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG；引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG；所述反应液II包含以下检测引物：引物TUF1：GAATTGGTTGAAATGGAAAT；引物TUR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA；引物CNSF1:GAATTGGTTGAAATGGAAAT；引物CNSR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA；引物FKYBIF1:TGCTCACACAGATTGTCTG；引物YGR1:CAGGCGCTCTCCCAGCTGAG；引物FKR1:ATCCAGATTTTTAAAGAGCA；引物QYR1:CTTGTTCCAGATTGTTAAAGAGCA；引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG；引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG；所述反应液III包含以下检测引物：引物VANF1:TAGGCTGCGATATTCAAAGCTC；引物VANR1:AACAGCCTGCTCAATTAAGATTTT；引物VANR2:CCGACCTCACAGCCCGAAA；引物MEF1:CGTTCAATTTAATTTTGTTAAA；引物MER1:TTTTAGATACATTCTTTGGAAC；引物ECOF1:GTCTGCAATTGCCACCACTG；引物ECOR1:GCCGAATCGCTGCTGGAAG；引物ECOF2:CATATCTTCTTCCAGATTGC；引物ECOR2:GCTGTTTGGCTATGAGGAAG；引物ITSF1:GGTTTCCGTAGGTGAAC；引物ITSR1:GCATCCCACGGGCTCTCACC；引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG；引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG；所述反应液IV为HotstartTaqDNA聚合酶。2.根据权利要求1所述用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述捕获探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹华立，唐小利，郑银娜，裘惠良，
申请(专利权)人：杭州千基生物科技有限公司，杭州博芯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33