The invention discloses a primer, probe, kit and application for detecting Mycobacterium tuberculosis and its drug-resistant gene, the kit includes: amplification reaction solution, enzyme mixture solution and chip, the amplification reaction solution includes the primer, the chip includes a shell and a test strip fixed inside the shell for detecting Mycobacterium tuberculosis and its drug-resistant gene; the test paper The strip comprises a sample pad, a marking pad, a solid-phase carrier and a water absorbent paper which are arranged on the backlight plate and are successively overlapped; the solid-phase carrier is crosslinked with the probe. The detection condition of the kit is simple, the detection speed is fast and the detection cost is low. It is especially suitable for carrying out the on-demand detection field, promoting the detection of tuberculosis and its drug resistance to the grass-roots medical institutions, and improving the positive rate of the pathogen of tuberculosis. The invention can detect the nucleic acid of the Mycobacterium tuberculosis complex group and does not cross react with the non Mycobacterium tuberculosis, and the invention comprises Detection of two drug resistance mutations.
【技术实现步骤摘要】
一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因的引物及探针、试剂盒及应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因的引物及探针、试剂盒及应用。
技术介绍
结核分枝杆菌是一种古老的病原体，能够引起人体结核病，是人类健康的重要威胁，被称为白色瘟疫，世界卫生组织将结核菌检出率作为结核诊疗的重要指标，结核分枝杆菌核酸检测已经成为检测结核分枝杆菌复合群的重要手段。结核病的检测主要采用的方法包括荧光定量PCR(聚合酶链式反应)以及多种恒温扩增方案。荧光定量PCR技术是目前最成熟的核酸检测技术，灵敏度和特异性均较高，而且引物设计相对简单，也容易实现多重扩增，因此，可以既进行结核分枝杆菌检测又进行结核分枝杆菌耐药检测，因此，该方法是目前结核检测技术的主流。然而，由于采用的是变温扩增技术，需要大量的仪器设备和专业的场地和检验人员，而且操作也较为繁琐；此外，需要检测时间和检测样本数量造成医院需要累积一定量的样本后才能进行检测，从而使核酸检测结核分枝杆菌复合群的时效性大大降低。采用恒温扩增方法检测结核分枝杆菌，由于采用了恒温扩增技术，其不再需要昂贵的检测仪器来实现升降温功能，检测整体成本下降，此外，由于恒温扩增所在的最适扩增温度在荧光定量对已经有建设分子诊断实验室的医院也有一定的用处。目前在结核方面应用的主要恒温扩增技术包括：交叉引物恒温扩增技术是一种利用引物交叉技术打开扩增链的技术，然而，由于该技术引物数量本身较多，在多重扩增上存在技术障碍。RPA技术(recombinasepoly...
【技术保护点】
1.一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因的引物及探针，其特征在于，包括：具有SEQ IDNO.1-10所示核苷酸序列的引物，以及，具有SEQ ID NO.11-15所示核苷酸序列的探针；在SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.9所示核苷酸序列中，自5’端标记生物素；在SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14/SEQ IDNO.15所示核苷酸序列中，自5’端标记氨基。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因的引物及探针，其特征在于，包括：具有SEQIDNO.1-10所示核苷酸序列的引物，以及，具有SEQIDNO.11-15所示核苷酸序列的探针；在SEQIDNO.1/SEQIDNO.3/SEQIDNO.5/SEQIDNO.7/SEQIDNO.9所示核苷酸序列中，自5’端标记生物素；在SEQIDNO.11/SEQIDNO.12/SEQIDNO.13/SEQIDNO.14/SEQIDNO.15所示核苷酸序列中，自5’端标记氨基。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，在SEQIDNO.11/SEQIDNO.12/SEQIDNO.13/SEQIDNO.14/SEQIDNO.15所示核苷酸序列中，自5’端标记淬灭基团，自3’端标记荧光基团。
3.一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因的试剂盒，其特征在于，包括：扩增反应液、酶混合液、及芯片，所述扩增反应液中包含权利要求1所述的引物，所述芯片包括壳体和固定在所述壳体内部用于检测结核分枝杆菌及其耐药基因的试纸条；
所述试纸条包括设置在背光板上的依次搭接的样品垫、标记垫、固相载体和吸水纸；
所述固相载体上交联有权利要求1-2任一项所述的探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体上包含有质控线C位置、结核分歧杆菌位点、InhA15位点、KatG位点、RopB位点及IC内标，结核分歧杆菌位点亮表示有结核分枝杆菌感染，InhA15位点亮表示InhA基因启动子15位点发生突变，KatG位点和RopB位点亮均表示该位点未发生突变，IC位点为内标位点，所述试剂盒能够进行两种耐药基因突变检测。
所述扩增反应液还包括：TrisAc缓冲液、醋酸钾、PEG20000、dNTPs、磷酸肌酸、肌酸激酶、磷酸肌酸二钠盐、DTT和BSA；所述酶混合液包括：T4UVSX蛋白、T4UvSY蛋白、T4gp32蛋白、BSUDNA聚合酶或klenow片段，所述扩增反应液与所述酶混合液分装在两个管内，使用前将两者混合均匀；
所述的探针与点样液配合之后交联到所述NC膜中，所述点样液包括探针、甘油、硫柳汞、台盼蓝及10×PBS；
所述标记垫包括胶体金、彩色乳胶微球及量子点中的任一种，在所述标记垫上标记SA；
所述固相载体为NC膜、玻璃片、PVDF膜中的任一种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括稀释液、含有内标的核酸、醋酸镁，所述稀释液加入芯片储液槽内用锡箔纸密封，所述醋酸镁加入储液槽的加样区并风干。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述内标为含有下列片段的质粒或质粒菌：
ttgcatcagaagaactaaattttgatacttactggctagagcatcattttactgaatttggactaacaggtaacctgtttgttgcttgtgctaacttacttggtcgaaccaccaaactgaatgttggtactatgattgttcttccaacagctcaccctgcacgtcagatggaagatttattacttttagatca；
所述固相载体为NC膜，所述标记垫为彩色乳胶微球，
所述稀释液包括醋酸铵、醋酸钾、TritonX-100、柠檬酸三钠及水。
7.一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因试剂盒的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
第一步，配制扩增反应液和酶混合液；
第二步，制备芯...
【专利技术属性】
技术研发人员：李娇，田平，陈亚球，陈玉，毛小三，
申请(专利权)人：深圳市芯思微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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