恒温扩增检测新型冠状病毒的引物对、试剂盒、试剂盒的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种恒温扩增检测新型冠状病毒的引物对、试剂盒、试剂盒的制备方法及应用，试剂盒包括扩增反应液、酶冻干粉、芯片，扩增反应液中包括引物，其中引物如SEQ ID NO.1‑8所示，在SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列中的5’端均标记地高辛或荧光基团，试纸条上含有与上述引物相对应的抗体，分别作为各自的检测标记。使用本发明专利技术中试剂盒可一次检出三个不同区段，避免多次检测；恒温条件即可进行，既可在实验室进行仪器检测，又可让疑似对象进行自测，提高检测效率；检测时间短；可一人一检，随到随检；含有内标可以有效监控提取效率。

Preparation of novel coronavirus primers, kit, kit and application of isothermal amplification

【技术实现步骤摘要】
恒温扩增检测新型冠状病毒的引物对、试剂盒、试剂盒的制备方法及应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种恒温扩增检测新型冠状病毒的引物对、试剂盒、试剂盒的制备方法及应用。
技术介绍
新型冠状病毒经过呼吸道飞沫传播，亦可通过密切接触传播；人群普遍易感，老年人和有基础疾病者易发展为重症感染，儿童患者偶有发病。然而，由于新型冠状病毒存在初始症状不明显，潜伏期长达14天等相对隐蔽的因素，其患者和携带者往往不能及时发现，因此，研发一种能够快速检测相关病例的诊断试剂，从而能够及时、快速、准确、有效地对新型冠状病毒进行检测，是防范疫情的现实需要。由于病毒自身的特点，在该新型冠状病毒防控中，检测是控制疫情的最基本的手段，而及时对疑似症状者和密切接触者进行鉴别，可以有效稳定患者情绪，控制疫情进一步扩散。最理想的检测方案是能够实现随到随检，一例一检，以便能够在最初的2-3小时内鉴别感染者，防止交叉感染和症状不明显患者更大范围的播散疫情。由于该新型冠状病毒比较新颖，对其抗原抗体的相关研究目前还不完善，目前的核酸诊断技术是突发传染病疫情的重要检测手段，因此核酸检测将成为该新型冠状病毒病原体检测的主要手段，目前应对新冠状病毒感染的主要检测手段就是核酸检测，根据国家卫健委《新型冠状病毒引起的肺炎实验室检测技术指南》和《新型冠状病毒感染的肺炎防治指南》(第四版)中将两次检出特异性核酸或检出两个区段的特异性核酸作为诊断标准。目前国家药监局已经批准的5个应急诊断产品全部采用的核酸诊断技术：其中4个采用了荧光PCR技术，华大基因的测序检测试剂盒采用了基因测序技术。采用PCR荧光探针法和基因测序法等方法和技术检测新型冠状病毒，不仅需要在较高等级的实验室中进行，还需要较高等级的临床基因扩增实验室和人员防护要求，受人员，场地，防护等方面的限制；单个实验室每天检测的样本数量严重受限，不能快速完成对大规模人群的筛查；此外，受扩增/测序等仪器使用时间和资源成本等限制，无法做到一例一检，随到随检，增加了患者确诊的时间成本，不利于对疫情的控制。因此，研发一种能够快速检测相关病例的诊断试剂，从而能够及时、快速、准确、有效地对新型冠状病毒进行检测，是防范疫情的现实需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种恒温扩增检测新型冠状病毒的引物对、试剂盒、试剂盒的制备方法及应用。本专利技术适用于POCT(即时检测)、少量散发性病例及疾控检测，采用本专利技术试剂盒进行检测具有简单快速的特点，适合现场检测和随到随检。本专利技术的技术方案如下：提供一种恒温扩增检测新型冠状病毒的引物对，所述新型冠状病毒具体为2019-nCoV，所述引物对如SEQIDNO.1-8所示，在SEQIDNO.2/SEQIDNO.4/SEQIDNO.6/SEQIDNO.8所示的核苷酸序列中的5’端标记地高辛或荧光基团。进一步地，在SEQIDNO.1/SEQIDNO.3/SEQIDNO.5/SEQIDNO.7所示的核苷酸序列中的5’端均标记生物素，在SEQIDNO.2/SEQIDNO.4/SEQIDNO.6/SEQIDNO.8所示的核苷酸序列中的5’端依次标记FAM、TAMRA、Dig和AMCA。本专利技术还提供一种检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括：扩增反应液、酶冻干粉及芯片，所述扩增反应液中包含如上所述的引物，所述芯片包括用于检测新型冠状病毒的试纸条，所述试纸条上包含有若干抗体，若干所述抗体分别作为如上所述的引物的相应检测标记。进一步地，所述试纸条上包含的所述抗体为抗FITC、抗AMCA、抗罗丹明、抗毛地黄素抗体中的一种或多种。所述扩增反应液还包括反应体系、逆转录酶和/或核酸内切酶；所述扩增反应液与所述酶冻干粉分别盛装，使用前将两者混合均匀。所述反应体系为TwistDx公司的RPA反应体系，或所述反应体系的配方为：终浓度为40mM的TrisAc缓冲液、终浓度为140mM的KOAc、终浓度为7％的甘露、终浓度为6％海藻糖、终浓度为100mM的dNTPs、终浓度为200μM的ATP、终浓度为20ng/μL的肌酸激酶、终浓度为100ng/μL的磷酸肌酸二钠盐、终浓度为20μM的DTT和终浓度为10μg/ml的BSA。所述逆转录酶为AMV逆转录酶或MMLV。所述核酸内切酶为HindIII和/或大肠杆菌核酸内切酶III。所述酶冻干粉为TwistDx公司的RPA酶冻干粉，或使用以下浓度的混合酶进行冻干：终浓度为120ng/μL的T4UVSX蛋白、终浓度为30ng/μL的T4UvSY蛋白、终浓度为40ng/μL的T4gp32蛋白、终浓度为0.1U/μL的BSU或klenow片段，冻干骨架为蔗糖。进一步地，还包括阴性对照和阳性对照，其中阳性对照为通过盔甲RNA方法制备的含扩增片段的假病毒，阴性对照为灭活人细胞培养液或含有内标片段的序列。本专利技术还提供一种检测新型冠状病毒试剂盒的制备方法，所述试剂盒为如上所述的试剂盒，所述制备方法包括扩增反应液的制备和芯片的制备。所述芯片的制备包括：储液槽的制备、试纸条的制备、芯片组装、芯片检测及芯片包装，其中所述储液槽的制备和所述试纸条的制备的顺序能够调整。进一步地，所述扩增反应液的配制是按照所有引物0.8μL/5人份、反应体系29.5μL/5人份、逆转录酶和/或核酸内切酶0.5μL/5人份的比例配制而成。所述储液槽的制备过程包括：1)配制稀释液，向芯片储液槽中加入上述配好的稀释液，对缓冲液区域进行密封；2)配制醋酸镁溶液，向储液槽加样区加入配制好的醋酸镁溶液，自然风干。所述试纸条的制备过程包括：1)配制点样液，并在试纸条的固相载体上进行点样、固定及封闭；2)乳胶微球的活化及偶联体的标记，并将玻纤膜浸入活化后的乳胶微球中，烘干得到结合垫；3)样品垫的制备，配制样品垫处理液，将另一玻纤膜浸入所述样品垫处理液中，烘干得到样本垫；4)试纸条的组装，将背光板前部贴膜撕开，贴上结合垫，结合垫前段伸出固相载体并与样品垫接触，将背光板后部贴膜撕开，贴上吸水纸；5)试纸条的切条。其中，所述试纸条的制备过程中步骤1)至步骤3)的顺序能够调整。进一步地，所述储液槽的制备过程中的所述稀释液包括终浓度为0.9％的NaCl、终浓度为0.1％的Tween-20、终浓度为20mM的柠檬酸三钠和水，所述稀释液配制完成后用固体NaOH调节PH到12-13之间。所述醋酸镁溶液的配制采用分子生物级醋酸镁和Tris制备而成。所述点样液的配制是用点样稀释液将各个抗体稀释至1-50μg/mL的浓度。所述固相载体为NC膜、玻璃片、PVDF膜中的任一种，所述在固相载体上点样具体为：将背光板中部贴膜撕开，贴上固相载体，用点样仪将上述配好的点样液按照2×2阵列依次点制于固相载体上，点好的固相载体于37℃烘干30min。所述乳胶微球的活化及偶联体的标记包括以下步骤：A、将乳胶微球与终浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种恒温扩增检测新型冠状病毒的引物对，所述新型冠状病毒具体为2019-nCoV，其特征在于，所述引物对如SEQ ID NO.1-8所示，在SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列中的5’端标记地高辛或荧光基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种恒温扩增检测新型冠状病毒的引物对，所述新型冠状病毒具体为2019-nCoV，其特征在于，所述引物对如SEQIDNO.1-8所示，在SEQIDNO.2/SEQIDNO.4/SEQIDNO.6/SEQIDNO.8所示的核苷酸序列中的5’端标记地高辛或荧光基团。


2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，在SEQIDNO.1/SEQIDNO.3/SEQIDNO.5/SEQIDNO.7所示的核苷酸序列中的5’端均标记生物素，在SEQIDNO.2/SEQIDNO.4/SEQIDNO.6/SEQIDNO.8所示的核苷酸序列中的5’端依次标记FAM、TAMRA、Dig和AMCA。


3.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：扩增反应液、酶冻干粉及芯片，所述扩增反应液中包含权利要求1或2所述的引物，所述芯片包括用于检测新型冠状病毒的试纸条，所述试纸条上包含有若干抗体，若干所述抗体分别作为权利要求1或2所述的引物的相应检测标记。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条上包含的所述抗体为抗FITC、抗AMCA、抗罗丹明、抗毛地黄素抗体中的一种或多种；
所述扩增反应液还包括反应体系、逆转录酶和/或核酸内切酶；所述扩增反应液与所述酶冻干粉分别盛装，使用前将两者混合均匀；
所述反应体系为TwistDx公司的RPA反应体系，或所述反应体系的配方为：终浓度为40mM的TrisAc缓冲液、终浓度为140mM的KOAc、终浓度为7％的甘露、终浓度为6％海藻糖、终浓度为100mM的dNTPs、终浓度为200μM的ATP、终浓度为20ng/μL的肌酸激酶、终浓度为100ng/μL的磷酸肌酸二钠盐、终浓度为20μM的DTT和终浓度为10μg/ml的BSA；
所述逆转录酶为AMV逆转录酶或MMLV；
所述核酸内切酶为HindIII和/或大肠杆菌核酸内切酶III；
所述酶冻干粉为TwistDx公司的RPA酶冻干粉，或使用以下浓度的混合酶进行冻干：终浓度为120ng/μL的T4UVSX蛋白、终浓度为30ng/μL的T4UvSY蛋白、终浓度为40ng/μL的T4gp32蛋白、终浓度为0.1U/μL的BSU或klenow片段，冻干骨架为蔗糖。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照和阳性对照，其中阳性对照为通过盔甲RNA方法制备的含扩增片段的假病毒，阴性对照为灭活人细胞培养液或含有内标片段的序列。


6.一种检测新型冠状病毒试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒为权利要求3至5任一项所述的试剂盒，所述制备方法包括扩增反应液的制备和芯片的制备；
所述芯片的制备包括：储液槽的制备、试纸条的制备、芯片组装、芯片检测及芯片包装，其中所述储液槽的制备和所述试纸条的制备的顺序能够调整。


7.根据权利要求6所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述扩增反应液的配制是按照所有引物0.8μL/5人份、反应体系29.5μL/5人份、逆转录酶和/或核酸内切酶0.5μL/5人份的比例配制而成；
所述储液槽的制备过程包括：
1)配制稀释液，向芯片储液槽中加入上述配好的稀释液，对缓冲液区域进行密封；
2)配制醋酸镁溶液，向储液槽加样区加入配制好的醋酸镁溶液，自然风干；
所述试纸条的制备过程包括：
1)配制点样液，并在试纸条的固相载体上进行点样、固定及...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娇，陈亚球，田平，周宇航，
申请(专利权)人：深圳市芯思微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44