促进血管生成的骨髓间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种促进血管生成的骨髓间充质干细胞外泌体，其中所述外泌体为超顺磁性Fe3O4或γ‑Fe2O3纳米颗粒或者超顺磁性Fe3O4或γ‑Fe2O3纳米颗粒联合静磁场诱导骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，相比未经处理的骨髓间充质干细胞的外泌体，本发明专利技术的外泌体具有显著增强血管内皮细胞增殖、迁移和成血管的能力。本发明专利技术还提供了所述骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，所述外泌体可用于制备促进血管生成的制剂、治疗缺血性疾病的药物和修复患病或受损组织的药物，在组织再生和修复治疗以及缺血性疾病治疗方面具有很大的应用潜力。

Exosome of bone marrow mesenchymal stem cells promoting angiogenesis and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
促进血管生成的骨髓间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种促进血管生成的骨髓间充质干细胞(BMSC)外泌体(EXO)及其制备方法和应用。
技术介绍
间充质干细胞(MSC)具有重要的组织修复和再生的生物学特性,其具有促进血管新生的能力,已被广泛应用于缺血性疾病等的治疗。MSC促进血管新生的机制与促血管生长因子分泌及外泌体的生成有关。外泌体(exosome)是细胞经“内吞-融合-外泌”等一系列调控行为分泌到细胞外环境中的直径为40-150nm的膜性小囊泡，由源自多泡体的磷脂双层或真核细胞的质膜组成，在细胞的旁分泌作用中扮演极为重要的角色，越来越多的研究表明,间充质干细胞可通过旁分泌外泌体而发挥对组织损伤的修复作用。Hu等人(HuGW,LiQ,NiuX,etal.Exosomessecretedbyhuman-inducedpluripotentstemcell-derivedmesenchymalstemcellsattenuatelimbischemiabypromotingangiogenesisinmice[J].StemCellResTher,2015,6(1):10)将人诱导多能干细胞(iPSC)来源的间充质干细胞外泌体移植到下肢缺血的小鼠体内，发现小鼠缺血后肢的毛细血管密度和血流灌注增加，肌肉坏死程度显著减轻，且有明显的肌组织再生；进一步研究显示，该外泌体能显著增强血管内皮细胞的增殖、迁移和成血管能力，并促进其表达一系列与血管生成密切相关的基因。血管生成是组织器官损伤后修复的前提条件，损伤的组织器官内血管生成的速度和数量决定创面愈合和组织器官修复的效果。以上研究结果充分表明，细胞旁分泌的外泌体可独立地作为一种生物活性成分应用于组织再生和修复治疗。磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米粒子具有超顺磁性和高饱和磁化强度，是一种磁性强、制备相对简单、生物相容性较好的磁性材料，其在磁共振成像、药物靶向载体等生物医学领域具有广阔的应用前景。具备超顺磁性的纳米粒子，在无外加磁场时，材料没有磁效应，在外加静磁场存在时，则可以展现出良好的磁性效应。同时磁性纳米粒子在降解过程中会产生Fe3+，Fe3+可以促进人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC)中血管生成因子的表达，可以促进血管的形成。因此，获得具有更好的促进成血管功能的骨髓间充质干细胞外泌体，提高组织再生和修复治疗能力以及缺血性疾病的治疗效果是人们当前的迫切愿望。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种促进血管生成的骨髓间充质干细胞外泌体，其中所述外泌体为超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒或者超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒联合静磁场诱导骨髓间充质干细胞分泌的外泌体。在本专利技术外泌体的一些实施方案中，所述外泌体为超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒诱导骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，并且所述超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒的刺激浓度为25-50μg/ml，优选50μg/ml。在本专利技术外泌体的一些实施方案中，所述外泌体为超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒联合静磁场诱导骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，并且所述超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒的刺激浓度为25-50μg/ml，优选50μg/ml；所述静磁场的刺激强度为50-100mT，优选100mT。在本专利技术外泌体的上述实施方案中，所述骨髓间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。本专利技术另一个方面还提供上述外泌体的制备方法，其包括如下步骤：1)培养骨髓间充质干细胞；2)用上述超顺磁性纳米颗粒或上述超顺磁性纳米颗粒联合静磁场处理上述骨髓间充质干细胞；3)骨髓间充质干细胞外泌体的提取、纯化。在本专利技术上述方法的一些实施方案中，步骤1)中细胞培养的具体操作是：取第3-5代生长良好的BMSC按1×104至1×105细胞/ml，优选1×105细胞/ml密度接种于容纳有含10％FBS、1％青链霉素的α-MEM完全培养基的细胞培养容器，置于5％体积CO2、37℃培养箱中培养。在本专利技术上述方法的一些实施方案中，步骤2)中处理细胞的具体操作是：所述培养细胞生长融合率达到70％以上时，将所述超顺磁性纳米颗粒以25-50μg/ml，优选50μg/ml浓度溶于上述α-MEM完全培养基中，对细胞进行培养；或者将所述超顺磁性纳米颗粒以25-50μg/ml，优选50μg/ml浓度溶于上述α-MEM完全培养基中后用50-100mT，优选100mT静磁场(SMF)刺激，对细胞进行培养。在本专利技术上述方法的一些实施方案中，步骤3)中外泌体提取、纯化的具体操作是：上述培养细胞生长融合率达到80％以上时，更换无血清α-MEM培养液，饥饿处理24h后收集上清，按照超速离心法提取外泌体：4℃下1000×g离心30min去除细胞碎片后，吸取上清液；0.22μm滤器过滤；4℃下100000×g离心2h，弃去上清；PBS重悬，再次4℃下100000×g离心2h，弃去上清；将提取的外泌体加入PBS重悬，于-80℃冻存备用。在本专利技术上述方法的一些实施方案中，所述骨髓间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。本专利技术一个方面还提供上述外泌体在制备促进血管生成的制剂中的应用。本专利技术另一个方面还提供上述外泌体在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用。本专利技术又一个方面还提供上述外泌体在制备修复患病或受损组织的药物中的应用。有益效果相比未经处理的骨髓间充质干细胞的外泌体，本专利技术提供的由骨髓间充质干细胞在超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒或者超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒联合静磁场诱导下分泌的外泌体具有显著增强血管内皮细胞增殖、迁移和成血管的能力，尤其是其中超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒联合静磁场诱导下分泌的外泌体比单纯超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒诱导下分泌的外泌体具有更好的增强血管内皮细胞增殖、迁移和成血管的能力。本专利技术还提供了所述骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，所述外泌体可用于制备促进血管生成的制剂、治疗缺血性疾病的药物和修复患病或受损组织的药物，在组织再生和修复治疗以及缺血性疾病治疗方面具有很大的应用潜力。附图说明图1A所示为与对照(Control)相比，不同浓度(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒处理1-5d对人骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖的影响。图1B所示为与对照(Control,0mTSMF)相比，经50μg/ml超顺磁性Fe3O4纳米颗粒处理的人骨髓间充质干细胞，进一步用不同强度的静磁场(50mT、100mT、200mTSMF)处理1-5d后，对人骨髓间充质干细胞增殖的影响。图2A所示为透射电镜下观察到的三种外泌体BMSC-Exo、BMSC-Fe3O4-Exo和BMSC-Fe3O4-SMF-Exo的形态，图中外泌体呈圆形或椭圆形结构，直径约50-100nm，有完整的包膜结构(箭头所示为外泌体)，内含低密度物质。图2B所示为纳米颗粒跟踪分析(NTA)检测的三种外泌体BMSC-Exo、BMSC-Fe3O4-Exo和BMSC-Fe3O4-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进血管生成的骨髓间充质干细胞外泌体，其特征在于，所述外泌体为超顺磁性Fe3O4或γ‑Fe2O3纳米颗粒或者超顺磁性Fe3O4或γ‑Fe2O3纳米颗粒联合静磁场诱导骨髓间充质干细胞分泌的外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种促进血管生成的骨髓间充质干细胞外泌体，其特征在于，所述外泌体为超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒或者超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒联合静磁场诱导骨髓间充质干细胞分泌的外泌体。2.如权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体为超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒诱导骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，并且所述超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒的刺激浓度为25-50μg/ml，优选50μg/ml。3.如权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体为超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒联合静磁场诱导骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，并且所述超顺磁性Fe3O4或γ-Fe2O3纳米颗粒的刺激浓度为25-50μg/ml，优选50μg/ml；所述静磁场的刺激强度为50-100mT，优选100mT。4.权利要求1-3中任一项所述外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)培养骨髓间充质干细胞；2)用所述超顺磁性纳米颗粒或者所述超顺磁性纳米颗粒联合静磁场处理上述骨髓间充质干细胞；3)骨髓间充质干细胞外泌体的提取、纯化。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中细胞培养的具体操作是：取第3-5代生长良好的BMSC按1×104至1×105细胞/ml，优选1×105细胞/ml密度接种于容纳有含10％FB...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海，吴狄，吴志宏，于凌佳，邱贵兴，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：北京,11