一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法，所述方法具体包括以下步骤：(1)从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞；(2)免疫磁珠筛选骨髓单个核细胞以获得BMSC；(3)对步骤(2)中获得BMSC进行流式分选，获得各类不同的细胞亚群；(4)对步骤(2)(3)中获得的BMSC进行单细胞转录组测序，检测细胞的基因表达。本发明专利技术取骨髓进行单个核细胞分离，采用首创的阶梯分离法，获得骨髓间充质干细胞(BMSC)中具有不同功能的细胞亚群，并通过单细胞转录组测序手段鉴定其功能。本发明专利技术能够解决现阶段BMSC分化效果难以控制，细胞治疗的有效成分少，疗效不佳等问题。

A method for isolation and purification of bone marrow mesenchymal stem cell subsets

【技术实现步骤摘要】
一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法
本专利技术涉及一种通过细胞表面标记特异性分离提纯人骨髓间充质干细胞亚群的方法。
技术介绍
骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSC)是存在于骨髓中的除造血干细胞以外的另一类具有“无限”增殖和多向分化潜能的干细胞。在一定的诱导条件下，这类细胞可定向分化为各胚层来源组织，特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞。例如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞和神经细胞等。BMSC具有贴壁易生长，体外易分离、扩增，外源性基因的易转入和表达的特性，被全球专家学者认为是干细胞治疗的一种理想细胞类型。近年来，干细胞治疗已成为生物医学研究的难点和热点问题，BMSC的治疗效果也被广泛认可，但是由于其多向分化能力，不仅具有成骨分化功能，还有调节造血、免疫抑制、成脂成纤维等作用，分化效果难以控制，也导致干细胞治疗的局限性。针对上述问题，专利技术人首次证实BMSC中存在更为精细的功能分群，其不同亚群具有显著的基因表达差异，在人群中发挥不同的功能。
技术实现思路
针对原有技术，为了弥补BMSC治疗中有效分化细胞含量低的不足，专利技术人选用前期首次发现BMSC各细胞亚群特异性表达的表面抗原，通过联合BMSC的特征表面抗原CD271，提供了一种简单高效的全新方法，可特异性分离提纯具有不同作用的细胞亚群，可用来治疗多种疾病。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法，所述方法具体包括以下步骤：(1)从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞；(2)免疫磁珠筛选骨髓单个核细胞以获得BMSC；(3)对步骤(2)中获得BMSC进行流式分选，获得各类不同的细胞亚群；(4)对步骤(2)(3)中获得的BMSC进行单细胞转录组测序，检测细胞的基因表达。本专利技术所述的一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法中，步骤(1)所述的健康人骨髓来源于自体或异体，获得途径可以是直接骨穿抽取骨髓或由骨髓库直接购买的健康人骨髓样本。本专利技术所述的一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法中，步骤(1)所述的密度梯度离心以获取单个核细胞的操作为：①将采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭后放入生物安全柜，抽取采血管中的骨髓分装到15ml的离心管中，每管骨髓9ml，加入1.5mlPEbuffer稀释，并通过提前双面润湿的100μm筛网过滤；②在新的15ml离心管底部加4.5mlFicoll-Pague分离液，倾斜离心管，再将滤过的骨髓，缓慢加到Ficoll-Pague分离液面上，使其呈清晰的界面，尽量避免出现骨髓侵入到分离液面之下，在离心力为500g、温度为20度的条件下离心35分钟；③离心后液面将分为4层，从底部向上分别为红细胞、Ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加PEbuffer12ml，混匀洗涤，在离心力为300g、温度为20度的条件下离心10分钟；④离心后弃上清，细胞沉淀先用15mlPEbuffer重悬，混匀，在离心力为200g、温度为20度的条件下离心12分钟；⑤离心后弃上清，细胞沉淀用10mlPEbuffer重悬，得到单个核细胞的细胞悬液。本专利技术所述的一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法中，所述PEbuffer为免疫磁珠分选所用的洗涤缓冲液(Washingbuffer)，可直接从MiltenyiBiotec公司购买或根据官网配方表的比例用PBS和EDTA混合配置。本专利技术所述的一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法中，步骤(2)所述的获得BMSC的操作为：①将步骤(1)获取的单个核细胞的细胞悬液进行细胞计数，并在离心力为300g、温度为20度的条件下离心10分钟；②根据细胞计数的结果，以每107个细胞60μlPBEbuffer的比例加入缓冲液重悬细胞；③根据细胞计数的结果，以每107个细胞20μl的比例分别加入CD271磁珠和FcR阻断剂，充分混匀后，于4度下冷却15分钟；④根据细胞计数的结果，以每107个细胞1.5mlPBEbuffer的比例加入缓冲液洗涤经过冷却后的细胞，混匀后在离心力为300g、温度为4度的条件下离心10分钟；⑤根据细胞计数的结果，以每108个细胞500μlPBEbuffer的比例加入缓冲液重悬细胞，若细胞数低于108个，至少添加500μlPBEbuffer重悬；将细胞悬液转移至专用的分选管中，使用全自动磁珠分选仪(由德国MiltenyiBiotec公司生产)进行细胞分选，筛选得到CD271阳性的BMSC细胞。本专利技术所述的一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法，所述PBEbuffer为免疫磁珠分选所用的运行缓冲液(Runningbuffer)，可直接从MiltenyiBiotec公司购买或根据官网配方表的比例用PBS、BSA和EDTA混合配置。本专利技术所述的一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法，步骤(3)所述的获得不同的CD271+骨髓间充质干细胞亚群的操作为：①将步骤(2)中获得的BMSC单细胞悬液在转速为900rpm、室温条件下离心5分钟，用PBS洗涤重悬后，重复一次该离心过程；②用适量PBS重悬细胞，加入特定表面抗原单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；③加入PBS洗涤两遍，在转速为900rpm、室温条件下离心5min，再用PBS重悬细胞；④通过流式细胞仪分选，分别获取抗原阳性细胞。本专利技术所述的一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法，步骤(4)所述的对获得的骨髓间充质干细胞亚群测序的操作为：①将步骤(2)得到的BMSC细胞进行10x单细胞转录组测序，检测目的基因在BMSC中的表达确定特定功能的细胞亚群分布，验证选取的特殊表面抗原在该细胞亚群的特异性表达情况；②将步骤(3)得到的细胞亚群进行10x单细胞转录组测序，检测目的基因在该细胞亚群的表达。本专利技术所述的一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群方法中，可用以分离提纯骨髓间充质干细胞的表面抗原有许多种(TrkB、CD295、CD151、GHR、LEPR、CD233…)可用以分离提纯不同的细胞亚群。本专利技术具有以下有益的效果：本专利技术在现有的BMSC提取技术的基础上，专利技术了一种利用细胞表面抗原标记，阶梯式特异性分离具有不同功能的细胞亚群的方法，获得了可用以治疗多种疾病的细胞亚群，克服了现阶段干细胞治疗的有效成分少，疗效不佳等问题。附图说明图1为BMP5在BMSC中的表达分布图；图2为GHR在BMSC中的表达分布图；图3为BMP5在GHR+CD271+细胞亚群中的表达分布图；图4为CD233在BMSC中的表达分布图；图5为CD151在BMSC中的表达分布图。具体实施方式以下通过具体的实例对本专利技术的内容作进一步的阐述说明，本专利技术包括但不限于下述步骤和内容。实施例1：选用GHR(生长激素受体)为实例，进行对具有高成骨分化能力的细胞亚群的分离提纯：1、从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞①通过骨穿抽取健康成人骨髓于采血管中，将采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭后放入生物安全柜，抽取采血管中的骨髓分装到15ml的离心管中，每管骨髓9ml，加入1.5mlPEbuffer稀释，并通过提前双面润湿的100μm筛网过滤；②在新的15ml离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：(1)从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞；(2)免疫磁珠筛选骨髓单个核细胞以获得BMSC；(3)对步骤(2)中获得BMSC进行流式分选，获得各类不同的细胞亚群；(4)对步骤(2)(3)中获得的BMSC进行单细胞转录组测序，检测细胞的基因表达。

【技术特征摘要】
1.一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：(1)从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞；(2)免疫磁珠筛选骨髓单个核细胞以获得BMSC；(3)对步骤(2)中获得BMSC进行流式分选，获得各类不同的细胞亚群；(4)对步骤(2)(3)中获得的BMSC进行单细胞转录组测序，检测细胞的基因表达。2.按照权利要求1所述的一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法，其特征在于，步骤(1)所述的健康人骨髓来源于自体或异体，获得途径可以是直接骨穿抽取骨髓或由骨髓库直接购买的健康人骨髓样本。3.按照权利要求1所述的一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法，其特征在于，步骤(1)所述的密度梯度离心以获取单个核细胞的操作为：①将采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭后放入生物安全柜，抽取采血管中的骨髓分装到15ml的离心管中，每管骨髓9ml，加入1.5mlPEbuffer稀释，并通过提前双面润湿的100μm筛网过滤；②在新的15ml离心管底部加4.5mlFicoll-Pague分离液，倾斜离心管，再将滤过的骨髓，缓慢加到Ficoll-Pague分离液面上，使其呈清晰的界面，尽量避免出现骨髓侵入到分离液面之下，在离心力为500g、温度为20度的条件下离心35分钟；③离心后液面将分为4层，从底部向上分别为红细胞、Ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加PEbuffer12ml，混匀洗涤，在离心力为300g、温度为20度的条件下离心10分钟；④离心后弃上清，细胞沉淀先用15mlPEbuffer重悬，混匀，在离心力为200g、温度为20度的条件下离心12分钟；⑤离心后弃上清，细胞沉淀用10mlPEbuffer重悬，得到单个核细胞的细胞悬液。4.按照权利要求3所述的一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法，其特征在于，所述PEbuffer为免疫磁珠分选所用的洗涤缓冲液。5.按照权利要求1所述的一种分离提纯骨髓间充质干细胞亚群的方法，其特征在于，步骤(2)所述的获得BMSC的操作为：①将步骤(1)获取的单个核细胞的细胞悬液进行细胞计数，并在离心力为...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶琳，陶正博，温凯程，
申请(专利权)人：中国医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21