一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法，属于干细胞领域。该方法包括：从骨髓中分离单个核细胞，扩增培养得到细胞表型CD73、CD90和CD105为阳性的骨髓间充质干细胞。在培养过程中使用了无血清培养基，通过优化培养基的成分及各组分之间的配比，有效避免了异种蛋白和外源微生物的污染，培养得到的干细胞形态和干细胞特性良好，显著提高了细胞增殖速率和骨髓间充质干细胞阳性表达率。该方法为规模化骨髓间充质干细胞制备和细胞移植治疗提供了新的途径。

A method of serum-free culture of bone marrow mesenchymal stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法
本专利技术属于干细胞领域，具体涉及一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法。
技术介绍
骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)来源于中胚层未分化的间充质细胞，具有向多种中胚层组织细胞分化的能力，如分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等。近年来发现BMSCs具有跨胚层分化的潜力，如分化为内胚层来源的心肌细胞，外胚层来源的神经细胞等。跨胚层分化能力的发现为BMSCs的应用创造了更广阔的前景。BMSCs可以在不同的理化环境和细胞因子的诱导下具有可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞甚至神经元样细胞等多系分化潜能。近年来，干细胞研究的迅猛发展为干细胞新药产品的研发提供了科学依据。特别是在心血管疾病领域，干细胞治疗新药研发尤为明显。在2011年到2016年间，韩国、加拿大、意大利、欧盟、日本等国家先后批准了治疗心梗干细胞药物。可以说，干细胞治疗的时代已经来临，同时以干细胞技术为核心的再生医学产业的战略布局和国际竞争也已拉开序幕。而规模化培养干细胞是干细胞治疗的基础。目前，在干细胞的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，比较常用的是胎牛血清或新生小牛血清。血清是由许多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白。但它也含有一些不利于细胞生长的抑制因子或毒性物质，具有潜在的细胞毒性作用。血清中大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，同时也给细胞培养表达产品分离纯化带来很大的困难。比如，中国专利CN105238749B公开了一种复苏骨髓间充质干细胞的方法，该方法提供了含10％胎牛血清的DMEM培养基扩增培养骨髓间充质干细胞，但是胎牛血清等动物血清可能存在动物携带的已知或未知病原体，对以后可能的临床应用构成威胁，对规模化培养增加了难度。再如，中国专利CN101412985B公开了用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，通过在基础培养基中添加胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、亚硒酸钠、生长因子、贴壁因子、激素、腐胺、无机盐、维生素、白蛋白和抗氧化剂，能使骨髓间充质干细胞在无血清条件下贴附于培养介质，实现体外培养和扩增，并维持多向分化的潜能，但是以0.5*104个/mL作为初始细胞量，扩增培养10天后细胞数量仅为2*105个/mL，细胞增殖能力远没有达到规模化培养的要求。可见，现有技术中采用的骨髓间充质干细胞培养方法存在细胞增殖速率不够理想、培养基成分复杂等问题。因此，建立制备间充质干细胞的培养方法、培养体系避免动物源成分、获得质量可靠的、数量可观的间充质干细胞，是干细胞产业亟待解决的关键问题。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法，通过该方法制备得到的骨髓间充质干细胞细胞增殖速率高并且能够避免减少血清成分的引入。一方面，本专利技术涉及一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法，所述的方法包括以下步骤：(1)从骨髓中分离单个核细胞，制成细胞悬液，统细胞计数，调整细胞密度，得到骨髓单个核细胞；(2)将步骤(1)得到骨髓单个核细胞接种到细胞培养板中，使用无血清培养基进行培养，得到骨髓间充质干细胞原代细胞；(3)当步骤(2)得到的原代细胞达到80％-90％融合时，进行细胞传代并使用无血清培养基进行扩增培养，得到骨髓间充质干细胞。其中，所述的无血清培养基包括：基础培养基和营养培养基；所述的基础培养基包括：L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐和L-缬氨酸；所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、胆红素、铁和肌酐；所述的血小板衍生生长因子为血小板衍生生长因子AB和血小板衍生生长因子BB中的一种或几种；所述的转化生长因子为转化生长因子-β。优选地，所述的基础培养基包括：L-丙氨酸15-25mg/L、L-精氨酸盐酸盐80-100mg/L、L-天门冬氨酸30-50mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐20-30mg/L、L-谷氨酸70-80mg/L、L-谷氨酰胺250-350mg/L、L-组氨酸25-30mg/L、L-异亮氨酸50-60mg/L、L-亮氨酸50-60mg/L、L-赖氨酸70-80mg/L、L-蛋氨酸12-18mg/L、L-苯丙氨酸25-30mg/L、L-脯氨酸35-45mg/L、L-丝氨酸20-25mg/L、L-苏氨酸45-50mg/L、L-色氨酸8-12mg/L、酪氨酸二钠盐50-55mg/L和L-缬氨酸42-45mg/L；所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子AB38-42ng/mL、血小板衍生生长因子BB20-25ng/mL、成纤维细胞生长因子7-10ng/mL、表皮生长因子3-5ng/mL、β-转化生长因子95-100ng/mL、葡萄糖280-300mg/dL、甘油三酯80-90mg/dL、胆固醇140-150mg/dL、胆红素0.2-0.4mg/dL和FeCl370-80μg/dL。更优选地，所述的营养培养基还包括：0.5-5mg/dL肌酐。再进一步优选地，所述的基础培养基包括：L-丙氨酸20mg/L、L-精氨酸盐酸盐90mg/L、L-天门冬氨酸40mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐25mg/L、L-谷氨酸75mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、L-组氨酸28mg/L、L-异亮氨酸55mg/L、L-亮氨酸55mg/L、L-赖氨酸75mg/L、L-蛋氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸28mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-丝氨酸23mg/L、L-苏氨酸48mg/L、L-色氨酸10mg/L、酪氨酸二钠盐53mg/L和L-缬氨酸43mg/L；所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子AB40ng/mL、血小板衍生生长因子BB22ng/mL、成纤维细胞生长因子8ng/mL、表皮生长因子4ng/mL、β-转化生长因子98ng/mL、葡萄糖290mg/dL、甘油三酯85mg/dL、胆固醇145mg/dL、胆红素0.3mg/dL、FeCl375μg/dL和1.1mg/dL肌酐。其中，所述的无血清培养基中基础培养基和营养培养基的体积比为1:2-4；优选地，体积比为1:3。其中，所述的无血清培养基的pH值为6.5-7.5；优选地，所述的无血清培养基的pH值为7.0。其中，步骤(2)和(3)中所述的培养为在温度36-38℃，4-6％CO2的条件下进行细胞培养；优选地，所述的培养为37℃、5％CO2。其中，步骤(3)中所述的骨髓间充质干细胞的细胞表型为：CD73阳性、CD90阳性、CD105阳性、CD34阴性、HLA-DR阴性和CD45阴性。另一方面，本专利技术涉及一种上述方法在制备骨髓间充质干细胞中的应用。与现有技术相比，本专利技术所实现的技术效果如下：(1)本专利技术使用无血清的扩增培养基，避免了免疫反应和微生物污染。(2)本专利技术提供的无血清培养基由基础培养基和营养培养基组成，二者合理配本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：(1)从骨髓中分离单个核细胞，制成细胞悬液，统细胞计数，调整细胞密度，得到骨髓单个核细胞；(2)将步骤(1)得到骨髓单个核细胞接种到细胞培养板中，使用无血清培养基进行培养，得到骨髓间充质干细胞原代细胞；(3)当步骤(2)得到的原代细胞达到80％‑90％融合时，进行细胞传代并使用无血清培养基进行扩增培养，得到骨髓间充质干细胞；所述的无血清培养基包括：基础培养基和营养培养基；所述的基础培养基包括：L‑丙氨酸、L‑精氨酸盐酸盐、L‑天门冬氨酸、L‑半胱氨酸盐酸盐、L‑谷氨酸、L‑谷氨酰胺、L‑组氨酸、L‑异亮氨酸、L‑亮氨酸、L‑赖氨酸、L‑蛋氨酸、L‑苯丙氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸、L‑苏氨酸、L‑色氨酸、L‑酪氨酸二钠盐和L‑缬氨酸；所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、胆红素和FeCl3。

【技术特征摘要】
1.一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：(1)从骨髓中分离单个核细胞，制成细胞悬液，统细胞计数，调整细胞密度，得到骨髓单个核细胞；(2)将步骤(1)得到骨髓单个核细胞接种到细胞培养板中，使用无血清培养基进行培养，得到骨髓间充质干细胞原代细胞；(3)当步骤(2)得到的原代细胞达到80％-90％融合时，进行细胞传代并使用无血清培养基进行扩增培养，得到骨髓间充质干细胞；所述的无血清培养基包括：基础培养基和营养培养基；所述的基础培养基包括：L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐和L-缬氨酸；所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、胆红素和FeCl3。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的无血清培养基中基础培养基和营养培养基的体积比为1:2-4。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的无血清培养基的pH值为6.5-7.5。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的血小板衍生生长因子为血小板衍生生长因子AB和血小板衍生生长因子BB中的一种或几种；所述的转化生长因子为转化生长因子-β。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的基础培养基包括L-丙氨酸15-25mg/L、L-精氨酸盐酸盐80-100mg/L、L-天门冬氨酸30-50...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜夕锋，刁昱，
申请(专利权)人：河北贝特赛奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13