本发明专利技术公开了一种检测APOE基因多态性的引物和探针及试剂盒。利用2对APOE特异性引物，分别扩增人类APOE基因112位点和158位点基因片段，设计特异性Taqman MGB探针，即在一个反应体系中通过两种不同通道检测一个SNP位点。在反应体系含有不同基因型模板的情况下，随着PCR扩增过程，释放不同的荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。本发明专利技术在保证检出特异性和灵敏度的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。
A primer, probe and kit for detecting APOE gene polymorphism
【技术实现步骤摘要】
一种检测APOE基因多态性的引物和探针及试剂盒
本专利技术涉及一种检测APOE基因多态性的引物和探针及试剂盒，属于基因多态性检测
技术介绍
人APOE基因位于第19号染色体长臂13区2带(19q13.2)上，含有4个外显子和3个内含子。APOE的合成是由位于一个基因位点上的三个等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一个等位基因对应于一个主要异构体产生三种纯合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三种杂合子(E2/3，E2/4，E3/4)共六种常见表型。APOE3/3型又称野生型。APOE的氨基酸序列的112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的交换决定了异构体的种类。APOE4在这两个位置上都是Arg；E2都是Cys；112位为Cys和158位是Arg者为APOE3异构体，自然人群中，基因频率ε3分布最高，APOE3/3表型分布约70％。见下表APOE基因是阿尔兹海默症的一个重要的遗传危险因素。APOE4等位基因与晚发性家族性AD和散发性AD相关，而APOE2等位基因则对此类疾病具有防护作用。每多遗传一个APOE4的等位基因，相应就增加45％的AD的患病危险,也使得其发病年龄提前。在晚发型家族性AD中,每个APOE4的等位基因能将发病年龄提前7-9年。APOE基因分型是目前除了影像学外，更及时和有效的针对阿尔兹海默症的风险评估方法；对阿尔兹海默症后期发病预测有较高的准确性，特别是家族性受检者；还可以对APOE4基因型人群进行风险预警。APOE的基因位点具有遗传多态性，多态性与个体血脂水平及动脉粥样硬化的发生发展密切相关。通过对APOE基因类型的检测，可以早期预测心脑血管疾病等的发病概率，反应个体血脂水平及动脉粥样硬化的发生发展，指导他汀类用药，并可以此实施健康管理，实现尽早预防。
技术实现思路
为了克服现有技术检测能力的不足，本专利技术利用2对载脂蛋白E(APOE)特异性引物，分别扩增人类APOE基因112位点和158位点基因片段，设计特异性TaqmanMGB探针(5’末端标记FAM荧光素和5’末端标记VIC荧光素)，即在一个反应体系中通过两种不同通道检测一个SNP位点。在反应体系含有不同基因型模板的情况下，随着PCR扩增过程，释放不同的荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。本专利技术设置了UNG酶+dUTP防污染措施，即PCR扩增利用UNG酶将可能存在的PCR产物污染充分降解。以排除由此可能引起的假阳性结果。本专利技术以人类GAPDH基因作为内参基因设计特异性引物和探针(5’末端标记ROX荧光素)，实时检测系统的工作情况，以此排除假阴性结果。本专利技术的基因多态性包括APOE基因112TT+158CC型(APOEε3/ε3型)、112TT+158TT型(APOEε2/ε2型)、112CC+158CC型(APOEε4/ε4型)、112T/C+158CC型(APOEε3/ε4型)、112TT+158T/C型(APOEε2/ε3型)、112T/C+158T/C型(APOEε2/ε4型)型基因多态性。本专利技术的技术方案如下：一种检测APOE基因多态性的引物和探针，包括检测APOE112位点ARMS引物和探针以及检测APOE158位点ARMS引物和探针。所述检测APOE112位点ARMS引物对及MGB探针包括：112T位点引物序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5；112C位点引物序列如SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13；112下游通用引物序列如SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、SEQIDNO.18；112T探针序列如SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22；112C探针序列如SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28；所述112T探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰FAM，3’端修饰NFQ-MGB；所述112C探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰VIC；3’端修饰BHQ1。所述检测APOE158位点ARMS引物对及MGB探针包括：158T位点引物序列如SEQIDNO.29、SEQIDNO.30、SEQIDNO.31、SEQIDNO.32、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.35、SEQIDNO.36、SEQIDNO.37、SEQIDNO.38；158C位点引物序列如SEQIDNO.39、SEQIDNO.40、SEQIDNO.41、SEQIDNO.42、SEQIDNO.43、SEQIDNO.44、SEQIDNO.45、SEQIDNO.46、SEQIDNO.47、SEQIDNO.48；158上游通用引物序列如SEQIDNO.49、SEQIDNO.50、SEQIDNO.51、SEQIDNO.52；158T探针序列如SEQIDNO.53、SEQIDNO.54、SEQIDNO.55、SEQIDNO.56；158C探针序列如SEQIDNO.57、SEQIDNO.58、SEQIDNO.59、SEQIDNO.60、SEQIDNO.61、SEQIDNO.62；所述158T探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰FAM，3’端修饰NFQ-MGB；所述158C探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰VIC,3’端修饰BHQ1。检测APOE基因多态性的试剂盒，包括上述的检测APOE基因多态性的引物和探针。优选地，检测APOE基因多态性的试剂盒，还包括检测内部质控的内参引物对及探针：内参上游引物序列如SEQIDNO.63、SEQIDNO.64、SEQIDNO.65；内参下游引物序列如SEQIDNO.66、SEQIDNO.67；内参探针引物序列如SEQIDNO.68、SEQIDNO.69、SEQIDNO.70；所述内参探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰ROX,3’端修饰BHQ2。优选地，检测APOE基因多态性的试剂盒，还包括具有抗PCR酶抑制剂的PCR预混液，所述预混液包含经修饰后的Hotstart-Taq聚合酶、UNG酶、MUSTANGPURPLE荧光校准染料、dNTP、MgCl2、PCRbuffer。优选地，检测APOE基因多态性的试剂盒，还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为混合APOE112C、112T、158T、158C基因质粒DNA；阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。混合APOE112C、112T、158T、158C基因质粒DNA为E2质粒112T/158T(SEQIDNO.71)、E4质粒112C/158C(SEQIDNO.72)。需要特别说明的是，本专利技术的重点技术特征在于通过在每个SNP位点的检测上设计两个引物和探针来实现基因多态性的检测，因此，本专利技术不局限于上述各个引物和探针的序列设计，其余本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测APOE基因多态性的引物和探针，其特征在于包括检测APOE 112位点ARMS引物和探针以及检测APOE 158位点ARMS引物和探针。
【技术特征摘要】
1.一种检测APOE基因多态性的引物和探针，其特征在于包括检测APOE112位点ARMS引物和探针以及检测APOE158位点ARMS引物和探针。2.根据权利要求1所述的检测APOE基因多态性的引物和探针，其特征在于,所述检测APOE112位点ARMS引物对及MGB探针包括：112T位点引物序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5；112C位点引物序列如SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13；112下游通用引物序列如SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、SEQIDNO.18；112T探针序列如SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22；112C探针序列如SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28；所述112T探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰FAM，3’端修饰NFQ-MGB；所述112C探针为Taqman探针，每个序列的5’端修饰VIC；3’端修饰BHQ1。3.根据权利要求1所述的检测APOE基因多态性的引物和探针，其特征在于,所述检测APOE158位点ARMS引物对及MGB探针包括：158T位点引物序列如SEQIDNO.29、SEQIDNO.30、SEQIDNO.31、SEQIDNO.32、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.35、SEQIDNO.36、SEQIDNO.37、SEQIDNO.38；158C位点引物序列如SEQIDNO.39、SEQIDNO.40、SEQIDNO.41、SEQIDNO.42、SEQIDNO.4...
【专利技术属性】
技术研发人员：李振韬，郭力榕，马雨微，
申请(专利权)人：江苏贝格尔生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。