一种在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤治疗用miRNA标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤治疗用miRNA标志物及其应用，属于分子生物学和基因工程技术领域，测血液样本中miR‑30a表达水平的试剂在制备治疗在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤产品中的应用，用于检测人血液样本的和用于检测小鼠或大鼠心肌样本中的所述miR‑30a的序列如SEQ：ID：NO：1所示。本发明专利技术首次提供一种用于IPostC预防或治疗I/R损伤的稳定性很好的药物组合物，为研制抗I/R损伤所致的心肌梗死的新药开辟新的途径。

A MicroRNA Marker for the Treatment of Ischemia Reperfusion Injury after Senile Myocardial Ischemia and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤治疗用miRNA标志物及其应用
本专利技术属于分子生物学和基因工程
，涉及一种在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤治疗用miRNA标志物及其应用，具体地说，涉及一种miR-30a作为衰老心肌缺血后处理治疗缺血再灌注损伤的分子靶标及其应用。
技术介绍
随着老龄化社会的来临，人民生活质量的提高及心血管疾病危险因素的广泛流行，我国心血管疾病的发病率及死亡率逐年增长。其中，急性心肌梗死则是导致心血管疾病死亡的首要原因。近年来，随着药物及器械治疗的发展以及多条急性心梗绿色通道的共同努力，急性心梗的患者的血管得到了早期、及时的开通，使得急性心肌梗死的死亡率大大降低，然而缺血心肌再灌注后会发生阻止细胞代谢功能障碍及结构破坏进一步加重的现象，即心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤。I/R是心梗病人从再灌注治疗中获得最佳疗效的主要难题。有研究报道50％心梗病人年龄≥65岁，80％因心梗死亡的病人年龄≥65岁，提示65岁以上的老年人是缺血性心脏病的高危人群，同时动物及临床研究也观察到衰老心脏对I/R损伤更加敏感且病人预后差，因此深入研究老年心肌I/R损伤成为面临的重要课题。缺血后处理(ischemicpostconditioning,IPostC)是组织器官发生缺血后，在长时间的再灌注之前进行数次反复、短暂的再灌注/缺血处理或于再灌注前给予药物干预，以减轻组织再灌注损伤的处理措施，IPostC因其良好保护作用已成为抗I/R损伤研究的热点。IPostC的保护机制非常复杂，涉及到多种因素的共同参与，但是哪一种因素在后处理的保护机制中起主导作用，迄今尚未充分阐明。因此，如果从分子治疗的角度入手将有助于指导临床寻找IPostC保护I/R损伤的切入点，从而改善心肌对缺血的耐受性，促进心功能的恢复。microRNAs(miRNAs)是一种长度约22个核苷酸的内源性非编码RNA分子，通过碱基互补配对结合到靶基因mRNA的3’非翻译区(UTR)，导致其mRNA降解从而抑制靶基因的翻译。不同组织和细胞具有特异性的miRNAs，正常组织与病理组织中miRNAs的表达存在显著差异，因此寻找和确定各种疾病的特异性miRNAs已成为探索疾病的新靶点。每个miRNA可靶向数百甚至上千个基因，与此同时，一个基因也可受到多个miRNA调节，因此，miRNA-mRNA构成一个复杂的网络调控模式。miRNA表达水平的异常能够参与心血管疾病的多种病理生理过程，包括心肌损伤、心室重构和心肌再生等。因此，系统评价并确定衰老心肌组织特异性差异表达的miRNA将有利于我们更深入的理解IPostC保护衰老心肌I/R的机制。以慢病毒载体作为研究miRNA的手段已被更多的学者采用，利用慢病毒携带外源基因可以持续在宿主细胞内稳定表达的特点，可以持续稳定表达对衰老心肌细胞有某些特定功能的基因，建立稳定表达细胞系可以更好的对这一基因的生物学功能以及其应用价值进行深入研究。通过miRBase检索成熟miR-30a序列信息，TargetScan、miRanda等进行靶基因预测，miR-30a靶向抑制靶基因BECN1的表达。BECN1是酵母ATG6的同源物及参与哺乳动物的自噬相关基因，其主要是通过Ⅲ型PI3K形成一个复合体调节其他自噬相关蛋白定位于自噬前体结构，调节自噬活性。在哺乳动物细胞中已被证明上调BECN1基因能够刺激细胞自噬的产生。在众多的miRNA中，miR-30家族是在心肌细胞高丰度表达的miRNAs之一。以往实验证明，miR-30参与调节心肌肥大、心室重塑、心肌纤维化等一系列心脏功能异常的致病过程。最近关于miR-30a参与调控自噬的研究引起广泛关注，在肿瘤细胞里研究证实启动自噬发生的自噬相关蛋白BECN1是miR-30a的靶基因，也说明了miRNA在自噬调控中起着重要作用。而目前miR-30a在IPostC保护衰老心肌I/R损伤中的调控作用机制及对其细胞自噬进程影响的研究仍不清楚，因此，开发以miR-30a(其核苷酸序列如SEQ：ID：NO：6-SEQ：ID：NO：7)为策略的IPostC保护衰老心肌I/R损伤的预防、诊断和治疗的基础研究和抗I/R药物研究具有重要的意义和潜在的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤治疗用miRNA标志物及其应用，即一种miR-30a在衰老心肌细胞H9c2中稳定表达和沉默的细胞系及其在预防与治疗I/R疾病及抗I/R药物中的作用。其具体技术方案为：检测血液样本中miR-30a表达水平的试剂在制备治疗衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤产品中的应用，用于检测人血液样本的和用于检测小鼠或大鼠心肌样本中的所述miR-30a的序列如SEQ：ID：NO：1所示。进一步，所述试剂包括：通过qRT-PCR法检测miR-30a表达水平的试剂。再进一步，所述qRT-PCR法检测miR-30a表达水平的试剂至少包括一对扩增miR-30a的引物，该引物购自于广州市锐博生物科技有限公司。再进一步，所述引物的序列如SEQ：ID：NO：2-SEQ：ID：NO：3所示。再进一步，还包括miR-30a-5p反转录引物，其序列如SEQ：ID：NO：4所示。进一步，所述miR-30a的靶基因为BECN1，其核苷酸序列如SEQ：ID：NO：5所示。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术首次提供一种用于IPostC预防或治疗I/R损伤的稳定性很好的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的本专利技术上述所述的miR-30amimics、inhibitor和药学上可接受的病毒载体。此将成为新一代的I/R损伤所致的心肌梗死诊断标志物和治疗的分子靶标，也为研制抗I/R损伤所致的心肌梗死的新药开辟新的途径。附图说明图1为miR-30a在Sham、I/R及IPostC衰老心肌组织中的表达水平。*P<0.05,**P<0.01，为差异有显著性差异。图2为miR-30a在衰老心肌细胞经Normoxia、H/R及HPostC处理后的表达水平。*P<0.05,**P<0.01，为差异有显著性差异。图3A为慢病毒包装的rno-miR-30amimic,rno-miR-30ainhibitor,miR-neg侵染衰老心肌细胞后，显微镜下观察绿色荧光效率；注：a,HPostC；b,HPostC+miR-neg；c,HPostC+miR-30amimic；d,HPostC+miR-30ainhibitor；图3B为qRT-PCR检测慢病毒包装的rno-miR-30amimic,rno-miR-30ainhibitor,miR-neg侵染衰老心肌细胞后miR-30a的表达。*P<0.05,**P<0.01，为差异有显著性差异。图4为TargetScan预测软件对miR-30a靶基因进行预测发现BECN1是miR-30a的靶基因。图5A图为miR-30a与野生型和突变型BECN13’UTR结合模式图；图5B为双荧光素酶报告系统验证miR-30a靶向抑制BECN1荧光素酶活性。*P<0.05,**P<0.01，为差异有显著性差异。图6为west本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测血液样本中miR‑30a表达水平的试剂在制备治疗在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤产品中的应用，其特征在于，用于检测人血液样本的和用于检测小鼠或大鼠心肌样本中的所述miR‑30a的序列如SEQ：ID：NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.检测血液样本中miR-30a表达水平的试剂在制备治疗在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤产品中的应用，其特征在于，用于检测人血液样本的和用于检测小鼠或大鼠心肌样本中的所述miR-30a的序列如SEQ：ID：NO：1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：通过qRT-PCR法检测miR-30a表达水平的试剂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述qRT-PCR法检测miR-30a表达水平的试...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜怡邓，张慧萍，王艳华，徐灵博，张辉，丁宁，王睿，吴琪瑞，吴凯，杨勇，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：宁夏,64