替加环素耐药基因家族tetX多重PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种替加环素耐药基因家族tetX多重PCR检测试剂盒，由快速PCR混合液，超纯水，引物探针混合液，标准品，阴性对照品组成，引物探针混合液包括tetX1、tetX2、tetX3、tetX4、tetX5等引物对。本发明专利技术利用多重PCR的试验手段，建立了一套灵敏、高效的PCR检测方法，可对的含有tetX1、tetX2、tetX3、tetX4、tetX5基因的菌株进行快速、有效检测。具有成本低、效率高、操作方便、准确率高、能源消耗少、环境污染少等优点。

Tegacycline resistance gene family tetX multiplex PCR detection kit

【技术实现步骤摘要】
替加环素耐药基因家族tetX多重PCR检测试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一类新型替加环素耐药基因家族tetX多重PCR检测试剂盒。
技术介绍
四环素类抗生素(TCs)是一类广谱抗生素，对革兰氏阳性、阴性菌、衣原体、支原体和恶性疟原虫等均有较好的抑菌作用，被广泛应用于人和家畜的细菌感染预防及治疗，并且因低剂量四环素对动物的生长具有促进作用也大量用于农业及水产养殖业。四环素类抗生素的大量使用和排放促进了四环素抗性菌和抗性基因(tetracyclineresistancegenes,TRGs)的发展。目前已报道的TRGs有44种，根据作用机理主要分为3类:外排泵基因、核糖体保护基因和酶修饰基因。替加环素(Tigecycline)是惠氏公司研发的第三代四环素，它专门针对外排泵和核糖体保护抗性机制设计，可克服外排泵和核糖体保护机制介导的四环素抗性，对多种多重耐药菌如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)和携带新德里金属β-内酰胺酶1基因(NDM-1)的“超级细菌”肠杆菌均具有良好抑制效果，被誉为治疗由多重耐药的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌引起的复杂感染的最后一种抗生素之一。但含有tetX基因的宿主菌对其仍具有抗性。tetX基因可编码一个含有388个氨基酸、分子量为43.7kDa的蛋白(TetX)，其氨基端氨基酸序列与许多依赖NAD(P)的氧化还原酶相似，可对四环素进行化学修饰使其失活。2007年之前tetX基因仅发现存在于专性厌氧的拟杆菌属(Bacteroidesspp.)中。2007年Ghosh和LaPara在粪肥改良过的土壤中分离出一株含有tetX的鞘氨醇杆菌Sphingobacteriumsp.strainPM2P1-29，这是首次在好氧菌中发现tetX基因。除了上述两种菌属外，已知的tetX宿主菌还包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)，丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)中的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)和食酸戴尔福特菌(Delftiaacidovorans)及部分假单胞菌(Pseudomonadaceae)。目前，已在禽畜粪便、农田土壤、空气气溶胶、河水、池塘、港湾沉积物、污水厂进出水、活性污泥及剩余污泥等环境介质中检测到tetX基因。tetX及其直系同源基因(即tetX1，tetX2和tetX3)现已在肠杆菌科，鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌分离株中检测到。以往tetX的基因大多位于细菌的染色体上，流性传播的风险较为低，而且对替加环素的耐药能力较弱，没有引起较大的关注。2019年，沈建忠院士团队和刘亚红研究团队先后发现了携带tetX基因变异体的鲍曼不动杆菌和大肠杆菌各1株，其编码蛋白分别与已发现的野生型TetX具有85.1％和93.8％的氨基酸同源性，因此命名为tetX3(与之前报道tetX3不同，此处应该是tetX5)和tetX4。在基因可转移性研究中，科研人员发现，tetX4和tetX5均位于细菌的多重耐药质粒上，可通过接合转移进入肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌等临床重要病原菌中。更重要的是，动物试验模型证实了tetX变异体可导致临床上替加环素对携带该类耐药基因的病原菌感染治疗的失败。流行病学回溯性调查表明，tetX4和tetX5在国内动物源和食品源细菌中的平均检出率为6.9％，其中某些地区猪源大肠杆菌的检出率达到了66.7％，且有5株牛源不动杆菌同时携带了碳青霉烯耐药基因blaNDM-1和tetX5，还从3株人医临床感染源大肠杆菌和1株鲍曼不动杆菌中检出了tetX4，虽然检出率较低(0.07％)，但其风险不容忽视。在此前报道的tetX基因的相关检测方法中，大多只是针对一种抗性基因所设计的通过传统PCR或是real-timePCR反应。其往往只能检测一种抗性基因，在面对越来越多的tetX基因家族的其他基因出现的情况下，需要通过多个反应才能够对相关抗性基因进行较为全面的检测。在这样一种研究背景下，建立一套快速、有效的tetX基因家族的检测方法就显得十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种替加环素耐药基因家族tetX多重PCR检测试剂盒，本专利技术利用多重PCR的试验手段，建立了一套灵敏、高效的PCR检测方法，可对含有tetX1、tetX2、tetX3、tetX4、tetX5基因的菌株进行快速、有效检测。本专利技术提供的试剂盒，由快速PCR混合液(2×RapidTaqMasterMix)，超纯水，引物探针混合液，标准品(tetX1，tetX2，tetX3，tetX4，tetX5)，阴性对照品(不含有tetX1，tetX2，tetX3，tetX4，tetX5基因的pBAD24空载体)。引物探针混合液包括tetX1引物对、tetX2引物对、tetX3引物对、tetX4引物对、tetX5引物对。其中快速PCR混合液(2×RapidTaqMasterMix)包含TaqDNAPolymerase、延伸促进因子、dNTP以及优化的缓冲体系。引物探针混合液包括引物tetX1-F、tetX1-R、tetX2-F、tetX2-R、tetX3-F、tetX3-R、tetX4-F、tetX4-R、tetX5-F、tetX5-R。tetX1引物对的序列如SEQNo.1和SEQNo.2所示，tetX2引物对的序列如SEQNo.3和SEQNo.4所示，tetX3引物对的序列如SEQNo.5和SEQNo.6所示，tetX4引物对的序列如SEQNo.7和SEQNo.8所示，tetX5引物对的序列如SEQNo.9和SEQNo.10所示。上述标准品的保守区基因序列为：tetX1标准品序列如SEQNo.11所示，tetX2标准品序列如SEQNo.12所示，tetX3标准品序列如SEQNo.13所示，tetX4标准品序列如SEQNo.14所示，tetX5标准品序列如SEQNo.15所示。本专利技术提供的荧光定量试剂盒需于4℃储存。本专利技术试剂盒的使用方法：在每次标本检测中均应设立阳性对照和阴性对照。将待测菌液直接作为模板进行多重PCR检测。多重PCR反应体系(总体积50μL)为：引物探针混合液：10μL(工作浓度0.2μM)；模板：待测菌液2μL；快速PCR混合液(2×RapidTaqMasterMix)：25μL；超纯水：13μL。多重PCR反应程序：预变性95℃3min；变性95℃15s，退火59℃15s，延伸72℃20s共30个循环；终延伸72℃5min。多重PCR产物经2.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压110V，工作时间120min。本专利技术利用多重PCR的试验手段，建立了一套灵敏、高效的PCR检测方法，可对的含有tetX1、tetX2、tetX3、tetX4、tetX5基因的菌株进行快速、有效检测。具有成本低、效率高、操作方便、准确率高、能源消耗少、环境污染少等优点。附图说明图1表示用本试剂盒对阴性对照和阳性对照检测的标准结果，从左到右以此为阴性对照、tetX1，tetX2，tetX3，tetX4，tetX本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种替加环素耐药基因家族tetX多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由快速PCR混合液，超纯水，引物探针混合液，标准品，阴性对照品组成，引物探针混合液包括tetX1引物对、tetX2引物对、tetX3引物对、tetX4引物对、tetX5引物对。

【技术特征摘要】
1.一种替加环素耐药基因家族tetX多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由快速PCR混合液，超纯水，引物探针混合液，标准品，阴性对照品组成，引物探针混合液包括tetX1引物对、tetX2引物对、tetX3引物对、tetX4引物对、tetX5引物对。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中快速PCR混合液包含TaqDNAPolymerase、延伸促进因子、dNTP以及优化的缓冲体系。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，tetX1引物对的序列如SEQNo.1和SEQNo.2所示，tetX2引物对的序列如SEQNo.3和SEQNo.4所示，tetX3引物对的序列如SEQNo.5和SEQNo.6所示，...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯友军，徐勇昌，季凯，蒋承建，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33