一种用于HBV miR-3荧光定量PCR的检测材料及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于HBV miR‑3的荧光定量PCR检测材料及试剂盒，其中荧光定量PCR检测材料包括6组逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物和特异性荧光探针。提供的6组荧光定量PCR检测材料具有非常显著的特异性，直接使用SYBR Green染料，其阴性对照也基本不存在非特异干扰；结合TaqMan MGB探针后，阴性对照的非特异干扰完全消除，定量范围上，覆盖7个数量级，从10

A Detection Material and Kit for Fluorescent Quantitative PCR of HBV Mi-3

【技术实现步骤摘要】
一种用于HBVmiR-3荧光定量PCR的检测材料及试剂盒
本专利技术属于生物
，更具体地，涉及一种用于HBVmiR-3荧光定量PCR的检测材料及试剂盒。
技术介绍
miRNA作为一类重要的调节基因表达的内源性分子，已有大量的研究表明其具有疾病诊断，发展及预后判断的重要价值。比如在癌症领域，有大型队列研究验证了血清中组合miRNA检测可筛查早期肺癌；也有研究验证了血清中两种miRNA可作为前列腺癌患者手术治疗情况的评价因子。在传染病领域，研究发现病毒可编码miRNA，与肿瘤的发生有关，且病毒的miRNA可在患者血清中检测到，与炎症生物标志物相关。表明了病毒编码的miRNA在传染病领域具有潜在的疾病评价意义。乙型肝炎的发生是由乙肝病毒(HepatitisBvirus,HBV)慢性感染导致，中国的慢性感染率为5％-8％。在HBV的miRNA领域的研究中，2007年首次通过了生物信息学的分析发现了HBV可能编码miRNA，但并未得到验证。直到2017年，Yang等人验证了HBV可编码miRNA，确定了其序列并将其命名为HBVmiR-3，且通过生物学实验验证其存在。因此，这是第一篇公开发表HBVmiR-3的文献。该文献采用了Chen等人在2005年发表的茎环法RT-PCR(Stem-loopRT-PCR)的方法对HBV-miR-3进行检测，但Yang等人并未使用特异性荧光探针，因此该检测方法的特异性仍有待提高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种用于HBVmiR-3的荧光定量PCR检测材料。本专利技术要解决的另一技术问题是提供一种用于检测HBVmiR-3的SYBRGreen荧光定量试剂盒。本专利技术要解决的还一技术问题是提供上述试剂盒的使用方法。本专利技术要解决的还一技术问题是提供一种用于检测HBVmiR-3的TaqMan荧光定量试剂盒。本专利技术要解决的还一技术问题是提供上述试剂盒的使用方法。本专利技术所采取的技术方案是：提供一种用于HBVmiR-3的荧光定量PCR检测材料，包括以下A～F共6组逆转录引物、qPCR前引物和qPCR后引物，A：逆转录引物序列为：CGCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATACGCGAAACGCCGCA(SEQIDNO.1)；qPCR前引物序列为：TGTGCCCGCTGGATGTGTC(SEQIDNO.2)；qPCR后引物序列为：CGCGAGCACAGAATTAATACG(SEQIDNO.3)；B：逆转录引物序列为：CCCATCCCACACACAGCCTGCGAGACTGAGGGATGGGAAACGCCG(SEQIDNO.5)；qPCR前引物序列为：CCGCTGGATGTGTCTG(SEQIDNO.6)；qPCR后引物序列为：CTGCGAGACTGAGGGA(SEQIDNO.7)；C：逆转录引物序列为：CGCCATTACCCAGGCATACGATGACCAGGCGAAACGCCG(SEQIDNO.9)；qPCR前引物序列为：CGTCGCCGCTGGATGTGTCTG(SEQIDNO.10)；qPCR后引物序列为：CCATTACCCAGGCATACGATGACCA(SEQIDNO.11)；D：逆转录引物序列为：CTTCGTAATCGCTGCTATTACCCAGGCATACGATGACCAAGCAGCGATTACGAAGAAACGCCG(SEQIDNO.13)；qPCR前引物序列为：TCGCCGCTGGATGTGTCTG(SEQIDNO.14)；qPCR后引物序列为：TATTACCCAGGCATACGATGACCAA(SEQIDNO.15)；E：逆转录引物序列为：GCGTGGTCCACACCAGTTGACGGGCGACGACCACGCAAACGCCG(SEQIDNO.17)；qPCR前引物序列为：TCGCCGCTGGATGTGTCTG(SEQIDNO.18)；qPCR后引物序列为：CCACACCAGTTGACGGGC(SEQIDNO.19)；F：逆转录引物序列为：CTCAGCGGCTGTCGTGGACTGCGCGCTGCCGCTGAGAAACGCCG(SEQIDNO.21)；qPCR前引物序列为：TGCCCGCTGGATGTGTCTG(SEQIDNO.22)；qPCR后引物序列为：GGCTGTCGTGGACTGCG(SEQIDNO.23)。进一步地，所述检测材料对应的还包括A～F共6条特异性荧光探针，A：特异性荧光探针序列为：荧光基团-CTCACTATACGCGAAACG-淬灭基团(SEQIDNO.4)；B：特异性荧光探针序列为：荧光基团-AGGGATGGGAAACGCCG-淬灭基团(SEQIDNO.8)；C：特异性荧光探针序列为：荧光基团-CGAAACGCCGCA-淬灭基团(SEQIDNO.12)；D：特异性荧光探针序列为：荧光基团-AGCGATTACGAAGAAACGCC-淬灭基团(SEQIDNO.16)；E：特异性荧光探针序列为：荧光基团-ACGACCACGCAAACGCCG-淬灭基团(SEQIDNO.20)；F：特异性荧光探针序列为：荧光基团-CTGCCGCTGAGAAACGCCG-淬灭基团(SEQIDNO.24)。优选地，所述特异性荧光探针的荧光基团为羧基荧光素FAM；所述淬灭基团为MGB。提供一种用于检测HBVmiR-3的荧光定量试剂盒，包括逆转录试剂与荧光定量PCR试剂以及上述逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物。进一步地，所述逆转录试剂包括缓冲液体系、RNA酶抑制剂、dNTP和逆转录酶；荧光定量PCR试剂为SYBRGreen荧光定量染料体系。提供上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：S01.从待测样品中提取总RNA或富集小分子RNA；S02.将待测样品中提取的RNA逆转录合成cDNA；S03.于待测样品的cDNA中加入qPCR前引物、qPCR后引物、SYBRGreen荧光定量染料及其缓冲体系，进行荧光定量PCR检测。提供一种用于检测HBVmiR-3的荧光定量试剂盒，包括逆转录试剂与荧光定量PCR试剂以及如上述的逆转录引物、qPCR前引物、qPCR后引物、特异性荧光探针。进一步地，所述逆转录试剂包括缓冲液体系、RNA酶抑制剂、dNTP和逆转录酶；荧光定量PCR试剂为TaqMan荧光定量PCR体系。优选地，所述特异性荧光探针为TaqManMGB探针。上述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：S11.从样本中提取总RNA或富集小分子RNA；S12.将样本中提取的RNA逆转录合成cDNA；S13.于待测样品的cDNA中加入qPCR前引物、qPCR后引物、特异性荧光探针、TaqManqPCR酶及其缓冲体系进行荧光定量PCR检测。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术提供的6组荧光定量PCR检测材料具有非常显著的特异性，直接使用SYBRGreen染料，其阴性对照也基本不存在非特异干扰。2.本专利技术提供的6组荧光定量PCR检测材料，结合TaqManMGB探针后，阴性对照的非特异干扰完全消除，定量范围上，本专利技术在加入TaqMan探针后，定量范围覆盖7个数量级，从108至102，决定系数R2为0.997，表明本专利技术在定量方面覆盖范围广，定量效果好，在样品HBVmiR-3浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于HBV miR‑3的荧光定量PCR检测材料，包括以下A～F共6组逆转录引物、qPCR前引物和qPCR后引物，A：逆转录引物序列为：CGCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATACGCGAAACGCCGCA(SEQ ID NO.1)；qPCR前引物序列为：TGTGCCCGCTGGATGTGTC(SEQ ID NO.2)；qPCR后引物序列为：CGCGAGCACAGAATTAATACG(SEQ ID NO.3)；B：逆转录引物序列为：CCCATCCCACACACAGCCTGCGAGACTGAGGGATGGGAAACGCCG(SEQ ID NO.5)；qPCR前引物序列为：CCGCTGGATGTGTCTG(SEQ ID NO.6)；qPCR后引物序列为：CTGCGAGACTGAGGGA(SEQ ID NO.7)；C：逆转录引物序列为：CGCCATTACCCAGGCATACGATGACCAGGCGAAACGCCG(SEQ ID NO.9)；qPCR前引物序列为：CGTCGCCGCTGGATGTGTCTG(SEQ ID NO.10)；qPCR后引物序列为：CCATTACCCAGGCATACGATGACCA(SEQ ID NO.11)；D：逆转录引物序列为：CTTCGTAATCGCTGCTATTACCCAGGCATACGATGACCAAGCAGCGATTACGAAGAAACGCCG(SEQ ID NO.13)；qPCR前引物序列为：TCGCCGCTGGATGTGTCTG(SEQ ID NO.14)；qPCR后引物序列为：TATTACCCAGGCATACGATGACCAA(SEQ ID NO.15)；E：逆转录引物序列为：GCGTGGTCCACACCAGTTGACGGGCGACGACCACGCAAACGCCG(SEQ ID NO.17)；qPCR前引物序列为：TCGCCGCTGGATGTGTCTG(SEQ ID NO.18)；qPCR后引物序列为：CCACACCAGTTGACGGGC(SEQ ID NO.19)；F：逆转录引物序列为：CTCAGCGGCTGTCGTGGACTGCGCGCTGCCGCTGAGAAACGCCG(SEQ ID NO.21)；qPCR前引物序列为：TGCCCGCTGGATGTGTCTG(SEQ ID NO.22)；qPCR后引物序列为：GGCTGTCGTGGACTGCG(SEQ ID NO.23)。...

【技术特征摘要】
1.一种用于HBVmiR-3的荧光定量PCR检测材料，包括以下A～F共6组逆转录引物、qPCR前引物和qPCR后引物，A：逆转录引物序列为：CGCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATACGCGAAACGCCGCA(SEQIDNO.1)；qPCR前引物序列为：TGTGCCCGCTGGATGTGTC(SEQIDNO.2)；qPCR后引物序列为：CGCGAGCACAGAATTAATACG(SEQIDNO.3)；B：逆转录引物序列为：CCCATCCCACACACAGCCTGCGAGACTGAGGGATGGGAAACGCCG(SEQIDNO.5)；qPCR前引物序列为：CCGCTGGATGTGTCTG(SEQIDNO.6)；qPCR后引物序列为：CTGCGAGACTGAGGGA(SEQIDNO.7)；C：逆转录引物序列为：CGCCATTACCCAGGCATACGATGACCAGGCGAAACGCCG(SEQIDNO.9)；qPCR前引物序列为：CGTCGCCGCTGGATGTGTCTG(SEQIDNO.10)；qPCR后引物序列为：CCATTACCCAGGCATACGATGACCA(SEQIDNO.11)；D：逆转录引物序列为：CTTCGTAATCGCTGCTATTACCCAGGCATACGATGACCAAGCAGCGATTACGAAGAAACGCCG(SEQIDNO.13)；qPCR前引物序列为：TCGCCGCTGGATGTGTCTG(SEQIDNO.14)；qPCR后引物序列为：TATTACCCAGGCATACGATGACCAA(SEQIDNO.15)；E：逆转录引物序列为：GCGTGGTCCACACCAGTTGACGGGCGACGACCACGCAAACGCCG(SEQIDNO.17)；qPCR前引物序列为：TCGCCGCTGGATGTGTCTG(SEQIDNO.18)；qPCR后引物序列为：CCACACCAGTTGACGGGC(SEQIDNO.19)；F：逆转录引物序列为：CTCAGCGGCTGTCGTGGACTGCGCGCTGCCGCTGAGAAACGCCG(SEQIDNO.21)；qPCR前引物序列为：TGCCCGCTGGATGTGTCTG(SEQIDNO.22)；qPCR后引物序列为：GGCTGTCGTGGACTGCG(SEQIDNO.23)。2.根据权利要求1所述的检测材料，其特征在于，所述检测材料对应的还包括A～F共6条特异性荧光探针，A：特...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈希，崔毅峙，罗彦彰，王通，
申请(专利权)人：东莞微量精准检测研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44